程小梅，彭亞軍，周小毛，羅坤，柏連陽(yáng)

(1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.園藝研究所；b.植物保護(hù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

丁草胺(美國(guó)孟山都公司產(chǎn)品)選擇性強(qiáng)、殺草活性高，近年來(lái)一直是中國(guó)水稻田使用面積廣、施用量大的酰胺類除草劑[1]。盡管丁草胺屬于非長(zhǎng)殘效除草劑，但在土壤中的殘留期有1個(gè)月以上，在植株、土壤以及水體中的大量沉積，使得丁草胺藥害問(wèn)題頻頻發(fā)生[2]。解除丁草胺在土壤中的殘留和污染研究成為熱點(diǎn)[3]。土壤中的除草劑殘留主要通過(guò)物理、化學(xué)及生物學(xué)降解完成。生物修復(fù)是利用微生物的廣泛代謝途徑對(duì)污染物進(jìn)行處理，微生物降解農(nóng)藥，既高效安全，又運(yùn)行成本低，高效降解菌的篩選尤為關(guān)鍵[4–5]。筆者通過(guò)富集培養(yǎng)技術(shù)，從農(nóng)藥廠排污口、廢液池等長(zhǎng)期受丁草胺污染的土壤中，分離得到1株以丁草胺為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌C–5，研究了其在不同條件下的生長(zhǎng)和降解特性，及其對(duì)室內(nèi)盆栽水稻藥害的修復(fù)效果，以期為丁草胺藥害的生物修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用江蘇常隆化工有限公司農(nóng)藥廠長(zhǎng)期排放丁草胺的排污口、廢液池土壤作為富集培養(yǎng)的土壤來(lái)源。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：FeSO4·7H2O，0.02 g；CaSO4，0.08 g；MgSO4·7H2O，0.4 g；K2HPO4，0.2 g；(NH4)2SO4，0.2 g，1 000 mL 去離子水，pH7.0，121℃高壓蒸汽滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨5 g，氯化鈉10 g(固體培養(yǎng)基加瓊脂15 g)，1 000 mL去離子水，pH7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 方 法

1.2.1 降解菌的篩選

取5 g土樣，加入含50 mg/L的丁草胺無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，于 30 ℃恒溫?fù)u床黑暗振蕩培養(yǎng)(150 r/min)，每隔7 d接種體積分?jǐn)?shù)5%的菌液至同樣的新鮮培養(yǎng)基中，并且使丁草胺的質(zhì)量濃度以 50 mg/L的梯度遞增，至培養(yǎng)基中的丁草胺質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L，馴化約2個(gè)月。于LB培養(yǎng)基上劃線分離，挑取生長(zhǎng)較好的菌落分離純化3次，得到單一的菌株，保存于LB固體斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 降解菌的鑒定

1) 降解菌的形態(tài)和生理生化特性鑒定。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[6]進(jìn)行。

2) 降解菌的16S rDNA序列測(cè)定。提取細(xì)菌總DNA[7]，采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物[8]，引物F：5′–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3′，引物 R：5′–GGTTACCTTCT TACGACTT–3′。以提取的總DNA為模板，對(duì)篩選菌株的16S rDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×EX–Taq Buffer 2.5 μL，dNTP mix(25 mmol/L)2 μL，16S rDNA 引物(10 mmol/L)各0.4 μL，EX–Taq酶0.2 μL，基因組DNA模板1 μL，補(bǔ)水到總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 6 min，94 ℃變性 1 min，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用膠回收試劑盒純化回收(GENEray)，回收片段連接到pEASY T5，熱激30 s轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞，在含有50 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆斑于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，應(yīng)用M13F/R進(jìn)行菌液 PCR驗(yàn)證后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在 NCBI上進(jìn)行BLAST分析同源性，并采用MEGA5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育圖譜。

1.2.3 降解菌的降解條件優(yōu)化

1) 丁草胺的提取及色譜條件。將20 mL接種了菌體的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入125 mL分液漏斗中，分別用20、20、10 mL乙酸乙酯振蕩提取3次，有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉(350 ℃烘干4 h)過(guò)濾至濃縮瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，冷卻后加丙酮振蕩淋洗定容至10 mL，搖勻待測(cè)。

丁草胺的氣相色譜條件：氣相色譜儀為島津2010，色譜柱為 RTX–5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)[9]。2)考查環(huán)境pH和接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)及對(duì)丁草胺降解效果的影響。分別以接種量1%、5%、10%、15%、20%作為菌懸液添加量；分別以pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的0.1 mol/L配制的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)，150 r/min搖床30 ℃培養(yǎng)7 d，測(cè)定細(xì)菌的OD600值和對(duì)丁草胺的降解率[10]。

1.2.4 降解菌修復(fù)丁草胺對(duì)水稻幼苗藥害的盆栽試驗(yàn)

pH7.0緩沖液配制的半固體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基滅菌后，分別添加丁草胺至質(zhì)量濃度為5、10、20 mg/L，接種量5%、10%(OD600=1.34)，組合處理。菌液于室溫下12 000 r/min離心8 min，用無(wú)菌水洗脫菌體沉淀后加入培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜后，將萌發(fā)一致的水稻種子移栽至盆中，每盆10粒，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。于培養(yǎng)箱中16 h光照、8 h黑暗、30 ℃培養(yǎng)，5 d后觀察記錄出苗數(shù)、株高、根長(zhǎng)、鮮重。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的篩選及鑒定結(jié)果

通過(guò)富集培養(yǎng)和對(duì)降解單菌株的分離和純化，篩選出能以丁草胺為唯一碳源的單一菌株，將分離得到的單一菌株重新轉(zhuǎn)接到含有丁草胺20 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)驗(yàn)證其降解丁草胺的特性。通過(guò)測(cè)定各單一菌株的降解率，C–5菌株的降解率最高。

C–5菌株在LB平板上放置于培養(yǎng)箱30 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落乳白色，呈隆起、圓形、不透明狀。菌體形態(tài)經(jīng)掃描電鏡(SEM)觀察，大多以短鏈狀存在，只有少數(shù)以單個(gè)存在，如圖1所示。

C–5菌株淀粉水解反應(yīng)呈陰性、接觸酶反應(yīng)呈陽(yáng)性、脲酶反應(yīng)呈陽(yáng)性、V–P反應(yīng)陽(yáng)性、甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性、氧化酶反應(yīng)陽(yáng)性、明膠液化反應(yīng)陽(yáng)性。

降解菌株C–5序列已在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)為KC702840。將C–5菌株的16S rDNA序列與GenBank中的同源性較高的4個(gè)細(xì)菌模式株進(jìn)行比較，菌株 C–5的 16S rDNA 序列與代爾夫特菌屬(Delftia sp.)的4個(gè)種都有較高的序列同源性，構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2。C–5菌株的16S rDNA與Delftia tsuruhatensis (GenBank登錄號(hào)為GQ140326)，Delftia acidovorans (GenBank登錄號(hào)為GU459215)，Delftia lacustris(GenBank登錄號(hào)為JN644603)及Delftia sp.(GenBank登錄號(hào)為FJ688376)的相似性均為99%，且與Delftia sp.的幾個(gè)種共同組成1個(gè)分支。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果，結(jié)合生理生化特征，將C–5菌株鑒定為代爾夫特菌屬(Delftia sp.)。

圖1 菌株C–5在掃描電鏡下的菌體形態(tài)Fig.1 Cell morphology of strain C–5 under scanning electron microscope

圖2 C–5菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree for strain C–5

2.2 C–5菌株的降解特性

2.2.1 pH對(duì) C–5菌株生長(zhǎng)和對(duì)丁草胺降解效果的影響

當(dāng) pH=7時(shí)，C–5菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)最好，在強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿狀態(tài)下都不利于細(xì)菌生長(zhǎng)(圖3)。當(dāng)pH=7時(shí)，C–5菌株對(duì)丁草胺的降解率最高，偏酸或偏堿都影響細(xì)菌對(duì)丁草胺的降解能力。

圖3 C–5菌株在不同pH的生長(zhǎng)量及對(duì)丁草胺的降解率Fig.3 Influence of strain C–5 on growth and butachlor degradation under different pH

2.2.2 接菌量對(duì) C–5菌株生長(zhǎng)和對(duì)丁草胺降解效果的影響

由圖4可看出，隨著接菌量的增加，細(xì)菌的生長(zhǎng)量也隨之增加。在接菌量為5%時(shí)，細(xì)菌對(duì)農(nóng)藥的降解率最高。隨著接菌量的增大，降解率增幅不大，當(dāng)接菌量達(dá)到20%時(shí)，降解率反而會(huì)下降，這可能是由于細(xì)菌量過(guò)大而產(chǎn)生了某些有害中間代謝產(chǎn)物，抑制了有效降解菌的生長(zhǎng)的緣故。

圖4 C–5菌株在不同接種量的生長(zhǎng)量及對(duì)丁草胺的降解率Fig.4 Influence of strain C–5 on growth and butachlor degradation with different inoculation size

2.3 C–5菌株在最佳培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)量和對(duì)丁草胺的降解能力

由圖5可知，C–5菌株的生長(zhǎng)量在第7天時(shí)達(dá)到最大值，其生長(zhǎng)趨勢(shì)趨于平緩，對(duì)丁草胺的降解在第7天也達(dá)到最大。說(shuō)明隨著C–5對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)和生長(zhǎng)，對(duì)丁草胺的降解能力也愈來(lái)愈強(qiáng)，并同時(shí)在第7天達(dá)到最大。在培養(yǎng)的第1天降解率雖然不高，但是丁草胺的濃度也下降了。同時(shí)該菌株生長(zhǎng)比較快，在第1天就能生長(zhǎng)良好，說(shuō)明筆者對(duì)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的優(yōu)化比較成功。

圖5 C–5菌株的生長(zhǎng)及其對(duì)丁草胺的降解效果Fig.5 Growth curve of strain C–5 and degradation curve of butachlor with strain C–5

2.4 C–5菌株對(duì)水稻丁草胺藥害的修復(fù)效果

由表1可知，添加C–5菌株后對(duì)產(chǎn)生丁草胺藥害水稻的出苗率、株高、根長(zhǎng)、株鮮重均有比較明顯的修復(fù)效果。在丁草胺質(zhì)量濃度為 5 mg/L、接菌量為10%(OD600nm=1.34)時(shí)，出苗率達(dá)到87%，僅比空白低 10%，比未加菌組高 50%。株高比空白低 44%，比未加菌高 93%，對(duì)藥害的修復(fù)效果最好。此外在丁草胺質(zhì)量濃度10、20 mg/L下的修復(fù)效果雖然都不理想，但在10%接菌量下仍有一定的修復(fù)效果。

表1 C–5菌株不同接種量下的水稻藥害植株性狀Table 1 Character of butachlor injured rice inoculated with different amount of strain C–5

3 討 論

從長(zhǎng)期受丁草胺污染的農(nóng)藥廠排污地篩選到的代爾夫特菌屬的細(xì)菌 C–5，對(duì)丁草胺具有較好的降解能力，且能以丁草胺為唯一C源。通過(guò)富集馴化、生理生化特征和菌株形態(tài)相似性比較及 16S rDNA序列同源性分析，將菌株C–5鑒定為代爾夫特菌屬(Delftia sp.)。目前有學(xué)者在(2,4–D)[13]、苯胺[14]等中篩選出該菌屬。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的對(duì)丁草胺其降解作用的微生物主要有鉤桿菌屬[15]、不動(dòng)桿菌屬[16]、施氏假單孢菌[17]、副球菌屬(Paracoccus sp.)[18]、紅球菌屬(Rhodococcus sp.)[19]等，本研究篩選出的代爾夫特菌屬的細(xì)菌，豐富了丁草胺降解菌株的多樣性，為受丁草胺污染的土壤的生物修復(fù)提供了菌株資源。

盆栽試驗(yàn)表明，通過(guò)接種降解菌，能明顯減輕丁草胺對(duì)水稻植株的藥害。在丁草胺質(zhì)量濃度為5 mg/L，接菌量為10%的條件下，對(duì)丁草胺的藥害修復(fù)效果最好，修復(fù)后出苗率達(dá) 87%，總體修復(fù)效果達(dá) 50%以上。在驗(yàn)證了室內(nèi)盆栽藥害修復(fù)效果后，還將進(jìn)一步探索該菌株的最適發(fā)酵條件，配制高效發(fā)酵液投入大田，在自然環(huán)境下驗(yàn)證藥害修復(fù)效果。

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