張 宏朱政峰李 輝

（1 蘭州軍區(qū)空軍機(jī)關(guān)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州軍區(qū)空軍機(jī)關(guān)醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，甘肅 蘭州 730000）

帕金森病患者腦脊液中miR-9a的表達(dá)及其臨床意義

張 宏1朱政峰2李 輝1

（1 蘭州軍區(qū)空軍機(jī)關(guān)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000；2 蘭州軍區(qū)空軍機(jī)關(guān)醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，甘肅 蘭州 730000）

目的研究miR-9a在帕金森?。≒D）患者腦脊液中的表達(dá)，為帕金森病的早期診斷提供臨床檢測(cè)指標(biāo)。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)42例PD患者、24例普通頭痛患者和24例健康人腦脊液中miR-9a表達(dá)水平情況。分析腦脊液中miR-9a表達(dá)水平與PD相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果PD組患者腦脊液中miR-9a表達(dá)水平明顯高于頭痛組和健康對(duì)照組（P<0.05），且PD患者腦脊液中miR-9a表達(dá)與帕金森綜合評(píng)分量表（UPDRS）分級(jí)呈正相關(guān)（r=0.70，P<0.05）。ROC曲線確診PD患者的腦脊液miR-9a臨界值為0.667，其診斷敏感度為85.7%，特異度為77.9%。結(jié)論腦脊液miR-9a的檢測(cè)不僅有助于PD的診斷，也可能作為判斷PD病情的指標(biāo)之一。

帕金森??；腦脊液；miR-9a；生物標(biāo)志物

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是以黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失和Lewy小體出現(xiàn)為特異性改變，好發(fā)于中老年人，其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)50 歲以上人群中 PD 的患病率約為1%。由于PD患者可出現(xiàn)嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)功能障礙，如震顫、強(qiáng)直及動(dòng)作遲緩，嚴(yán)重者生活不能自理，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[2]。目前臨床上對(duì)于PD的診斷只能依靠患者臨床癥狀，而當(dāng)患者出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時(shí)，神經(jīng)元損害往往已經(jīng)達(dá)到了不可代償?shù)碾A段。因此，尋找一種可靠的、能早期診斷并跟蹤疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物，已成為目前研究PD的熱點(diǎn)。最近的研究表明，人的體液中存在穩(wěn)定表達(dá)的miRNAs。且PD患者腦脊液中miRNAs的表達(dá)與正常人存在比較明顯的差異[3]。有報(bào)道腦組織中miR-9a的表達(dá)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病密切相關(guān)。但腦脊液miR-9a能否作為PD診斷及病情評(píng)估的標(biāo)志物尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)PD患者腦脊液中的表達(dá)水平，探討miR-9a在PD的臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象：選取2009年10月至2013年10月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院的42例原發(fā)性PD患者為PD組。所有PD 患者的診斷均符合全國(guó)錐體外系疾病討論會(huì)制定的PD診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且排除其他腦變性疾病。UPDRS分級(jí)Ⅰ～Ⅲ。其中男性26例，女性16例；年齡57～77歲，平均（64.6 ±7.8）歲；病程2～6年。頭痛組為24例主訴頭痛患者，均排除腦血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)感染和腫瘤等器質(zhì)性病變。其中男性9例，女性15例，平均年齡（55.4±7.2）歲。健康對(duì)照組為24例健康人，其中男性12例，女性12例，平均年齡（50.7±6.4）歲。所有受試者及其家屬均被明確告知且簽署知情同意書。

1.2 主要設(shè)備和試劑：Trizol 試劑（Invitrogen公司）；TaqMan MicroRNA Assay和mirVana? miRNA Isolation Kit（Ambion公司）；ABI PRISM 7900 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司）；NanoDrop? ND-3300微量分光光度儀（ThermoFisher公司）；miR-9a及U6引物序列購(gòu)于北京天根生物工程有限公司。

1.3 腦脊液采集：所有受試者均采取腰椎穿刺的方式收集腦脊液?；颊呷?cè)臥位，在局麻下行腰椎穿刺，經(jīng)檢測(cè)顱內(nèi)壓無(wú)升高或降低，椎管無(wú)阻塞后。取無(wú)色清亮腦脊液約5～6 μL，室溫下1500 rpm/min離心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.4 RT-PCR：①Trizol法提取腦脊液RNA，NanoDrop? ND-1000全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。mirVana? miRNA Isolation Kit總RNA中分離出miRNA。②cDNA合成：按RT-PCR反應(yīng)試劑盒操作步驟制備10 μLRT反應(yīng)體系：mirVana5×RT Buffer 2 μL，1×mirVanaRT Primer 1 μL，Arrayseript Enzme Mix 0.4 μL，25 ng RNA，加無(wú)RNA酶水至總體積10 μL。在GeneAmp PCR System 9700進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：16 ℃ 30 min， 42 ℃ 30 min，83 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，冰浴冷卻，-80 ℃保存。③Realtime PCR反應(yīng)：采用TaqMan MicroRNA Assays，以U6為內(nèi)參基因，建立20 μL反應(yīng)體系：Product from RT reaction 1.33 μL，Taqman MicroRNA Assay（20×）1 μL，Taqman 2×Universal PCR Master Mix 10 μL，Nuclease-free water 7.67 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，（95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s）共40個(gè)PCR循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析miR-9a表達(dá)相對(duì)水平情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Sperman等級(jí)相關(guān)分析評(píng)估腦脊液miR-9a表達(dá)水平與UPDRS分級(jí)之間的相關(guān)性，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組腦脊液miR-9a表達(dá)水平比較：健康人腦脊液中miR-9a表達(dá)水平較低（0.25±0.04）；頭痛組腦脊液中miR-9a表達(dá)水平為（0.26± 0.07），與健康組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。PD組患者腦脊液中miR-9a表達(dá)水平相對(duì)值為（1.38±0.37），明顯高于健康對(duì)照組和頭痛組（P<0.05）（圖1）。

圖 1 不同組腦脊液miR-9a表達(dá)水平

2.2 腦脊液miR-9a表達(dá)情況在診斷PD上的效能評(píng)價(jià)：以腦脊液中miR-9a表達(dá)水平相對(duì)值為檢測(cè)變量，以分組為狀態(tài)變量，建立ROC曲線。結(jié)果顯示，腦脊液miR-9a診斷PD的ROC曲線下面積AUC為0.815。通過(guò)計(jì)算確定miR-9a診斷PD的最佳臨界值為0.667，在此臨界值下的診斷敏感度為85.7%，特異度為77.9%（圖 2）。

圖 2 ROC曲線

2.3 腦脊液miR-9a與PD組各因素之間的相關(guān)性分析：由表1可見(jiàn)，Sperman相關(guān)性分析顯示PD患者腦脊液miR-9a水平與年齡、病程無(wú)相關(guān)性（P>0.05），而與UPDR分級(jí)呈正相關(guān)（P<0.05）。

表1 miR-9a與PD組各因素相關(guān)性分析

3 討 論

PD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚不十分清楚，可能主要由于黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路變性和Lewy小體的形成導(dǎo)致DA能神經(jīng)元減少。由于PD發(fā)病隱匿，早期腦組織無(wú)明顯影像學(xué)改變，待神經(jīng)功能障礙癥狀時(shí)病變損害已不可逆轉(zhuǎn)。因此，早期診斷對(duì)于PD的治療具有非常熏要的臨床意義。

目前的研究證實(shí)，腦脊液的生化改變能夠反映大腦病理改變，因而在診斷神經(jīng)變性疾病方面較血清學(xué)更具敏感性和特異性。且由于受腦組織取材的限制，因此通過(guò)檢測(cè)腦脊液中PD相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物是早期診斷PD的最佳途徑[4]。近年來(lái)，腦脊液中PD相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物的研究已取得較大的進(jìn)展。如黃嘌呤、尿酸、β2苯乙胺、α-Synuclein蛋白、超氧化物歧化酶等腦脊液分子生物學(xué)指標(biāo)都被證實(shí)與PD的發(fā)生有關(guān)，且有成為PD生物標(biāo)志物的潛能[5]。但是，以上標(biāo)志物在診斷PD的敏感度和特異度上尚存在不足。

miR-9a是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在哺乳動(dòng)物腦組織中高度表達(dá)的miRNA，且其核苷酸100%保守。研究發(fā)現(xiàn)miR-9a在果蠅感覺(jué)器官前體細(xì)胞（SOP）中表達(dá)極其低下而在其臨近上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)。提示miR-9a可能對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元發(fā)育成熟和功能加以調(diào)控。且miR-9a可以通過(guò)調(diào)控SOP向感覺(jué)神經(jīng)元分化過(guò)程中必需的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而使SOP細(xì)胞向感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞分化[6]。最近Lukiw研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默?。ˋD）患者海馬內(nèi)miR-9表達(dá)水平明顯上調(diào)[7]。以上研究提示miR-9a與神經(jīng)系統(tǒng)地發(fā)育和疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，miR-9a在腦脊液的研究可能有利于為我們闡明PD的具體發(fā)病機(jī)制，也為早期診斷PD提供了一個(gè)潛在的標(biāo)志物。

本次研究我們采用RT-PCR檢測(cè)PD患者、頭痛患者和健康人腦脊液中miR-9a表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PD患者腦脊液中miR-9a表達(dá)水平明顯高于頭痛組和健康對(duì)照組（P<0.05）。同時(shí)，我們利用ROC曲線確定了腦脊液中miR-9a在診斷PD上的效能，發(fā)現(xiàn)腦脊液miR-9a診斷PD的ROC曲線下面積AUC為0.815。通過(guò)計(jì)算確定miR-9a診斷PD的最佳臨界值為0.667，且在此臨界值下的診斷敏感度為85.7%，特異度為77.9%。提示腦脊液中miR-9a的高表達(dá)可以作為PD的診斷指標(biāo)，且具有較高敏感度和特異度。此外，通過(guò)Sperman等級(jí)相關(guān)分析，PD患者腦脊液中miR-9a表達(dá)水平與患者年齡、病程無(wú)相關(guān)性（P>0.05），而與UPDR分級(jí)呈正相關(guān)（P<0.05）。提示可以通過(guò)檢測(cè)PD患者腦脊液中miR-9a表達(dá)水平來(lái)推測(cè)PD損傷程度。

綜上，本次研究結(jié)果提示腦脊液miR-9a可能成為新的PD診斷及判斷病情的標(biāo)志物，其具有較高敏感度和特異度。隨著對(duì)miRNA在神經(jīng)疾病領(lǐng)域內(nèi)的研究，miRNA將會(huì)成為PD疾病一個(gè)新的診斷和治療靶點(diǎn)。

[1] Dexter DT,Jenner P.Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms[J].Free Radic Biol Med,2013,62(1):132-144.

[2] 帕金森病診療指南[J].中國(guó)臨床醫(yī)生,2010,38(2):77-79.

[3] Machida A,Ohkubo T,Yokota T.Circulating microRNAs in the cerebrospinal fluid of patients with brain diseases[J].Methods Mol Biol,2013,1024(1):203-209.

[4] Shi M,Bradner J,Hancock A M,et al.Cerebrospinal fluid biomarkers for Parkinson disease diagnosis and progression[J].Ann Neurol, 2011,69(3):570-580.

[5] Ascherio A,Lewitt P A,Xu K,et al.Urate as a predictor of the rate of clinical decline in Parkinson disease[J].Arch Neurol,2009,66 (12):1460-1468.

[6] Li Y,Wang F,Lee J A,et al.MicroRNA-9a ensures the precise specification of sensory organ precursors in Drosophila[J].Genes Dev, 2006,20(20):2793-2805.

[7] Lukiw W J.Micro-RNA speciation in fetal,adult and Alzheimer's disease hippocampus[J].Neuroreport,2007,18(3):297-300.

R744

B

1671-8194（2014）36-0166-02