麥合蘇木·艾克木 努爾江·肉孜 于 洋 阿不都熱依木·玉蘇甫

(新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

維吾爾醫(yī)藥(簡(jiǎn)稱(chēng)維藥)神香草(Hyssopus officinalis L.)為唇形科(Labiatae)多年生草本植物，在新疆維吾爾自治區(qū)北部有野生分布?！毒S吾爾藥志》中記載道:藥用全草主要含黃酮、揮發(fā)油、生物堿等化學(xué)成分，常用于鎮(zhèn)咳平喘、清熱利濕。維吾爾醫(yī)用于治療氣管炎的咳嗽、氣喘、感冒發(fā)燒和風(fēng)濕等病證[1－2]。近年在新疆維吾爾自治區(qū)人工種植神香草獲得成功，為開(kāi)發(fā)和利用神香草的食用價(jià)值和藥用價(jià)值提供了充足的資源。本課題組對(duì)神香草抗哮喘藥效物質(zhì)及其作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)神香草水提物、醇提物具有顯著的抗炎、止咳、平喘作用，但至今尚未發(fā)現(xiàn)上述作用的報(bào)道。因此本研究采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)神香草醇提物進(jìn)行初步分離，制備神香草乙酸乙酯部位，通過(guò)小鼠抗炎、止咳、祛痰以及豚鼠平喘實(shí)驗(yàn)，探討神香草乙酸乙酯部位的抗炎、止咳、祛痰及平喘作用，從而為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑:神香草全草由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院藥房提供，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院制劑中心質(zhì)檢部鑒定為唇形科植物硬尖神香草(Hyssopus officinalis L.)的干燥地上部分(批號(hào):20110416)。神香草乙酸乙酯部位由本實(shí)驗(yàn)室制備，取2kg神香草藥材加12倍量的70%的乙醇提取3次，1h/次，提取液以1:3比例分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取3次，其中以乙酸乙酯部位濃縮，干燥，備用。氨茶堿(0.1g/片，四川錫成藥業(yè)有限公司，批號(hào):11070223)，急支糖漿(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，批號(hào):20111201);二甲苯(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào):100909);酚紅(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào):110908)，濃氨水(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào):110905);三氯化鋁(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào):110406);氯化乙酰膽堿(上海三思試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)030527);磷酸組織胺(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1200915);無(wú)水乙醇、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉(分析純)。

1.2 驗(yàn)動(dòng)物:昆明種小鼠18～22g，豚鼠160～200g，均為雌雄兼用，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證:SCXK(新)2011－0004]。

1.3 儀器:EYELAN－1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA公司)，DK－S24數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)，BL1500電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，UV－240型分光光度計(jì)(日本島津公司)，SK8210HP型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)公司)。

2 方法

2.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(抗炎作用):參照文獻(xiàn)[3－6]，取小鼠50只，隨機(jī)分成 5組:空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照組(急支糖漿，5.0g/kg)，神香草乙酸乙酯部位高、中、低劑量組(6.0g/kg、3.0g/kg、1.5g/kg);灌胃給藥，1次/日，連續(xù)7d，灌胃體積均為0.2mL/10g，末次給藥后30min，各組小鼠均在小鼠右耳前、后面均勻涂二甲苯20μL致炎，1h后頸椎脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑9mm打孔器分別在兩耳的同一部位打下耳片，精密稱(chēng)重，以左右耳重量差為腫脹度，以此判斷神香草乙酸乙酯部位對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響。

2.2 對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響(止咳作用):參照文獻(xiàn)[7]，取小鼠50只，隨機(jī)分成5組:空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照組(急支糖漿，5.0g/kg)，神香草乙酸乙酯部位高、中、低劑量組(6.0g/kg、3.0g/kg、1.5g/kg);灌胃給藥，1次/日，連續(xù) 7d，灌胃體積均為 0.2mL/10g，末次給藥后l h，將小鼠逐一放入4L密閉干燥容器內(nèi)，恒壓噴入25%濃氨水氣霧，噴霧5s引咳，觀察其咳嗽潛伏期及2min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

2.3 對(duì)小鼠氣管段酚紅排泌量的影響(祛痰作用):參照文獻(xiàn)[8]，取小鼠50只，隨機(jī)分成5組:空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照組(急支糖漿，5.0g/kg)，神香草乙酸乙酯部位高、中、低劑量組(6.0g/kg、3.0g/kg、1.5g/kg);灌胃給藥，1次/日，連續(xù) 7d，灌胃體積均為 0.2mL/10g，最后一次給藥后30min，每只小鼠腹腔注射5%酚紅生理鹽水溶液0.2mL/20g體重，30min后處死小鼠，仰位固定，頸部拉直，解剖分離出氣管，將各氣管段放入預(yù)先盛有1.5mL 5%NaHCO3溶液的試管中，超聲波清洗，使氣管段中的酚紅完全釋放，清洗液離心，取上清液，于分光光度計(jì)546nm處比色，測(cè)定OD值，與酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，折算成酚紅含量，根據(jù)酚紅含量和動(dòng)物體重計(jì)算出校正酚紅含量。

2.4 對(duì)豚鼠乙酰膽堿組胺引喘的影響(平喘作用):參照文獻(xiàn)[9]，取60只豚鼠，先將豚鼠逐一放在密閉的玻璃鐘罩內(nèi)，待安靜后，啟動(dòng)超生霧化器，以恒壓噴霧2%氯化乙酰膽堿與0.1%組胺1:1混合液15sec引喘，噴霧停止后，立即觀察6min內(nèi)豚鼠出現(xiàn)喘息性抽搐的潛伏期(從噴霧開(kāi)始到哮喘發(fā)作，呼吸極度困難，直至抽搐跌倒的時(shí)間)，選擇潛伏期小于150sec的豚鼠用于正式實(shí)驗(yàn)，并以此潛伏期作為給藥前潛伏期;挑選合格動(dòng)物，按體重、性別隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組(0.9%生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照組(氨茶堿，0.15g/kg)、神香草乙酸乙酯部位高劑量組(3.7g/kg)、神香草乙酸乙酯部位中劑量組(1.85g/kg)、神香草乙酸乙酯部位低劑量組(0.93g/kg);灌胃給藥，1次/日，連續(xù)7d，灌胃體積均為0.2mL/10g，末次給藥1h后，以同樣條件引喘，觀察引喘潛伏期，大于360s不跌倒者按360s計(jì)算，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組豚鼠的引喘潛伏期進(jìn)行比較。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以(±s)形式表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為顯著性差異;

3 結(jié)果

3.1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(抗炎作用):由表1可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組和3個(gè)不同劑量的神香草乙酸乙酯部位給藥組對(duì)二甲苯所致的小鼠耳腫脹均有明顯抑制作用(P＜0.05)，3個(gè)不同劑量的神香草乙酸乙酯部位給藥組腫脹抑制率呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，抑制作用隨劑量的增加而增加(P ＜0.05)。

表1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(mg，±s)

表1 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響(mg，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;神香草乙酸乙酯部位各劑量組之間比較，△P ＜0.05。

組別 n 劑量(g/kg)耳腫脹 抑制率(%)10 － 6.69±0.28 －陽(yáng)性對(duì)照組 10 5.0 3.07±0.41*54.11神香草乙酸乙酯部位 10 6.0 2.92±0.48＊△ 56.35神香草乙酸乙酯部位 10 3.0 3.50±0.25＊△ 47.68神香草乙酸乙酯部位 10 1.5 4.86±0.39＊△空白對(duì)照組27.35

3.2 對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響(止咳作用):由表2可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組和3個(gè)不同劑量的神香草乙酸乙酯部位給藥組對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)有明顯的抑制作用，能延長(zhǎng)小鼠咳嗽反應(yīng)的潛伏(P＜0.05)，并減少咳嗽次數(shù)(P＜0.05)，3個(gè)不同劑量的神香草乙酸乙酯部位給藥組止咳作用呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系(P＜0.05)。

表2 對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響(±s)

表2 對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽反應(yīng)的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;神香草乙酸乙酯部位各劑量組之間比較，△ P ＜0.05。

組別 n 劑量(g/kg)咳嗽潛伏期(s)咳嗽次數(shù)(次/2min)10 － 30.2±2.45 57.1±2.28陽(yáng)性對(duì)照組 10 5.0 61.5±6.75*22.8±0.81*神香草乙酸乙酯部位 10 6.0 60.3±8.34＊△22.9±1.57＊△神香草乙酸乙酯部位 10 3.0 37.4±6.38＊△25.7±1.45＊△神香草乙酸乙酯部位 10 1.5 32.7±4.46＊△31.2±0.92＊△空白對(duì)照組

2.3 對(duì)小鼠氣管段酚紅排泌量的影響(祛痰作用):由表3可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組和3個(gè)不同劑量的神香草乙酸乙酯部位給藥組能明顯提高小鼠呼吸道酚紅排泌量(P＜0.05)，3個(gè)不同劑量的神香草乙酸乙酯部位給藥組祛痰作用呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系(P ＜0.05)。

表3 對(duì)小鼠氣管段酚紅排泄量的影響(μg/ml，±s)

表3 對(duì)小鼠氣管段酚紅排泄量的影響(μg/ml，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;神香草乙酸乙酯部位各劑量組之間比較，△ P ＜0.05。

酚紅含量空白對(duì)照組 10 － 0.62±0.72*組別 n 劑量(g/kg)陽(yáng)性對(duì)照組 10 5.0 1.33±0.32*神香草乙酸乙酯部位高劑量組 10 6.0 1.29±0.53＊△神香草乙酸乙酯部位中劑量組 10 3.0 1.18±0.46＊△神香草乙酸乙酯部位低劑量組 10 1.5 1.01±0.39＊△

3.4 對(duì)豚鼠乙酰膽堿組胺引喘的影響(平喘作用):由表4可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組和3個(gè)不同劑量的神香草乙酸乙酯部位給藥組能明顯延長(zhǎng)豚鼠引喘潛伏期(P＜0.05);3個(gè)不同劑量的神香草乙酸乙酯部位給藥組引喘潛伏期呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系(P ＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 對(duì)組胺引起哮喘反應(yīng)的影響(sec，±s)

表4 對(duì)組胺引起哮喘反應(yīng)的影響(sec，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與給藥前比較，△P ＜0.05;神香草乙酸乙酯部位各劑量組之間比較，▲P＜0.05。

組別 n 劑量(g/kg)引喘前伏期10 － － 87.6±5.89 86.8±10.24陽(yáng)性對(duì)照組 10 0.15 84.1±5.73 118.9±15.09＊△神香草乙酸乙酯部位 10 3.7 85.6±6.15109.4±18.40＊△▲神香草乙酸乙酯部位 10 1.85 86.1±7.68101.5±25.69＊△▲神香草乙酸乙酯部位 10 0.93 86.8±6.1292.4±18.78給藥前 給藥后空白對(duì)照組＊△▲

4 討論

神香草的維吾爾名祖帕奇尼(祖帕)，維吾爾醫(yī)常用藥材，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)，維吾爾藥分冊(cè)》。藥用全草，含揮發(fā)油、黃酮、生物堿、多糖等化學(xué)成分。維醫(yī)用于治療氣管炎的咳嗽、氣喘、感冒發(fā)燒和風(fēng)濕等病癥。前期研究，發(fā)現(xiàn)神香草水、醇提物具有抗炎、止咳、平喘作用。因此，采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)神香草醇提物進(jìn)行萃取分離，制備其乙酸乙酯部位。對(duì)乙酸乙酯部位通過(guò)抗炎、止咳、祛痰、平喘實(shí)驗(yàn)考察有關(guān)作用，旨為神香草臨床應(yīng)用及治療提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在以血管通透性增加為主的急性炎癥模型中，神香草乙酸乙酯部位能顯著抑制二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹炎癥反應(yīng)(P＜0.05)，作用呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系(P＜0.05)，說(shuō)明神香草乙酸乙酯部位具有抗炎作用。同樣劑量的神香草乙酸乙酯部位能顯著抑制濃氨水噴霧引起的小鼠咳嗽反應(yīng)及延長(zhǎng)咳嗽潛伏期(P＜0.05)，提示神香草乙酸乙酯部位可能作用于有關(guān)咳嗽刺激的化學(xué)感受器，抑制支氣管黏膜對(duì)刺激的反應(yīng)。神香草乙酸乙酯部位能顯著促進(jìn)小鼠氣管段酚紅分泌量(P＜0.05);能顯著延長(zhǎng)乙酰膽堿組胺引起的哮喘潛伏期(P＜0.05)，作用均呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系(P ＜0.05)，提示神香草乙酸乙酯部位具有明顯的祛痰、平喘作用。

哮喘、慢性支氣管炎主要表現(xiàn)在咳、痰、喘癥狀，對(duì)其采用鎮(zhèn)咳、祛痰、解痙、平喘治療。神香草乙酸乙酯部位的抗炎、止咳、祛痰、平喘作用不僅為維藥神香草的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)于所含成分及作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

[1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草維吾爾藥卷[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005.12.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)，維吾爾藥分冊(cè)[S].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1999.78.

[3]徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京，北京人民衛(wèi)生出版社，2002:1359－1364.

[4]李儀奎，王欽茂.中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海:上?？萍汲霭嫔纾?002:436－439.

[5]侯仙，張凱，王亞利，等.肉桂鎮(zhèn)咳祛痰及平喘作用的藥效學(xué)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥雜志，2009，20(4):831－832.

[6]歐陽(yáng)勝，申作潔，潘琳娜.白桂木抗炎鎮(zhèn)痛作用有效部位篩選[J].中草藥，2010，41(11):1850－1853.

[7]Yuebin Ge，Jiaqi Liu，Dongfang Su.In vivo evaluation of the anti－ asthmatic，antitussive and expectorant activities of extract and fractions from Elaeagnus pungens leaf[J].Journal of Ethnopharmacology，2009，(129):538－542

[8]Na Hana，Chunling Changb，Yichun Wanga，Ting Huanga，Zhihui Liua，Jun Yina.The in vivo expectorant and antitussive activity of extract and fractions from Reineckia carnea[J].Journal of Ethnopharmacology，2010，(130):220－223

[9]張濤，田為真，米世偉，等.恰麻古爾提取物平喘止咳作用的初步探究[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32(9):1237－1239.