高偉城，藍曉慶，潘 馨

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學院藥學系，漳州363600;2.培力(南寧)藥業(yè)有限公司，南寧530007;3.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州350108)

綠衣枳殼總黃酮提取工藝的研究*

高偉城1，藍曉慶2，潘 馨3

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學院藥學系，漳州363600;2.培力(南寧)藥業(yè)有限公司，南寧530007;3.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福州350108)

目的:研究綠衣枳殼中總黃酮的提取工藝。方法:采用正交試驗法研究綠衣枳殼總黃酮的最佳提取工藝，考查了乙醇濃度、料液比、提取時間及提取次數(shù)對綠衣枳殼提取物中總黃酮量的影響。結果:確立了綠衣枳殼中總黃酮最佳提取條件為:90%的乙醇為溶劑、料液比為1∶10、提取時間為2 h、提取2次。結論:在最佳提取工藝條件下，綠衣枳殼提取物中總黃酮含量分別為60.914、60.788和60.915 mg/g，表明本研究提取工藝穩(wěn)定可行。

綠衣枳殼，總黃酮，提取工藝，正交試驗

綠衣枳殼來源于蕓香科植物枸橘Poncirus trifoliate (L.)Raf近成熟的果實，具有破積消食、理氣健胃的功效［1］。因品質優(yōu)良，長期以來遠銷臺灣地區(qū)、南韓、東南亞各國，是本省極具發(fā)展前途、可用于出口創(chuàng)匯的優(yōu)質傳統(tǒng)藥材［2］?，F(xiàn)代藥理表明，其對處于不同狀態(tài)的胃腸平滑肌具有雙向調節(jié)作用，而主要有效成分為黃酮類化合物［3］。潘馨［4］等采用GC－MS法對綠衣枳殼揮發(fā)油進行分析，結果表明綠衣枳殼與其他枳殼品種在化學成分烯、醇、酸、烷烴上絕大多數(shù)相同，從化學成分上可以解釋綠衣枳殼與枳殼有相同的用途。

因此，為深入研究其藥效價值，本研究采用正交試驗法優(yōu)選綠衣枳殼的乙醇提取工藝，以期為其制劑及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

Nicolet Evolution 300智能型紫外可見分光光度計(Thermo Scientific corporation)、FA2 104N萬分之一天平(上海精密科學儀器有限公司)、DZF－300真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)、RE－52旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，柚皮苷(中國藥品生物制品檢定所，批號110722－201111)，乙醇等其他試劑為分析純。綠衣枳殼藥材采購于福建閩侯，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院車蘇容副教授鑒定為綠衣枳殼Poncirus trifoliate(L.)Raf。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取120℃干燥至恒重的柚皮苷對照品5.6 mg，用90%乙醇超聲溶解，定容于25 ml的量瓶中，搖勻，即得，0.224 mg/ml的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的乙醇提取物干浸膏2.5 mg，用90%乙醇超聲溶解，定容于25 ml的量瓶中，搖勻，即得，備用。

2.2 測定波長的選擇將對照品及供試品溶液在200～400 nm范圍內進行波長掃描，結果對照品與供試品溶液在283 nm處均有最大吸收峰，故選擇283 nm作為檢測波長。見圖1。

圖1 紫外光譜圖

2.3 標準曲線的制備精密吸取柚皮苷對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 ml，分別置于25 ml的量瓶中，用90%乙醇超聲稱溶解并稀釋至刻度，搖勻;以90%乙醇溶液作空白對照，在283 nm處測定吸光度A，以吸光度A為縱坐標，質量濃度C為橫坐標，繪制標準工作曲線，得其回歸方程為:A= 0．026 6 C－0．020 4(r=0．999 9)，線性范圍為4.48～35.84 μg/ml。

2.4 加樣回收率試驗精密稱取同一樣品0.007 9 g，共6份，分別加入柚皮苷對照品，按照“2.1.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品液，在283 nm處測定其吸光度值，計算回收率。結果平均回收率為97.79%，RSD%為0.84%，結果見表1。

2.5 供試品溶液的測定將上述供試品溶液，按標準曲線下的測定方法測定其吸光度值，依回歸方程計算得到總黃酮的質量濃度，再計算干浸膏中的總黃酮量。

2.6 單因素試驗

2.6.1 乙醇濃度的考查精確稱取6份綠衣枳殼粗粉10.0 g，分別加入濃度為40%、50%、60%、70%、80%和90%的乙醇100 ml，料液比為1∶10，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液并減壓濃縮至干浸膏，按供試品溶液方法進行測定，重復3次，結果見表2;可知，隨著乙醇濃度的提高，綠衣枳殼總黃酮量呈上升趨勢，乙醇濃度為70%～90%時總黃酮含量高于其他的濃度。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

表2 __乙醇濃度對總黃酮量的影響

2.6.2 料液比的考查精確稱取6份綠衣枳殼粗粉10.0 g，分別加入濃度為80%的乙醇60、80、100、120、150和180 ml，料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15和1∶18，加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液并減壓濃縮至干浸膏，按供試品溶液方法進行測定，重復3次，結果見表3;可知，隨著料液比的升高，料液比為1∶12時總黃酮含量增加不是很明顯。

表3 料液比對總黃酮量的影響

2.6.3 提取時間的考查精確稱取6份綠衣枳殼粗粉10.0 g，分別加入濃度為80%的乙醇100 ml，料液比為1∶10，加熱回流提取2次，提取時間分別為1、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 h，合并提取液并減壓濃縮至干浸膏，按供試品溶液方法進行測定，重復3次，結果見表4;可知，隨著提取時間的延長，總黃酮含量于2.0 h處逐漸趨于平緩，在5.0 h時達到最高點。

表4 提取時間對總黃酮量的影響

2.7 正交試驗及其結果在實驗中，由于各因素之間相互交叉影響，因此為全面考慮乙醇提取法的工藝參數(shù)，根據(jù)單因素初篩試驗結果，確定以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)為四種因素進行正交試驗設計，我們以總黃酮量為考查指標，進行L9(34)正交試驗，以測定綠衣枳殼中總黃酮含量，因素水平表見表5，結果見表6，方差分析見表7。

表5 因素水平表

表6 L9(34)正交試驗結果

表7 方差分析

從極差和方差分析可知，以總黃酮含量為評價指標，各因素對提取效果的影響程度依次為A＞B＞D＞C，其中因素A(乙醇濃度)有顯著性影響，取A3即90%乙醇為提取溶劑，B、D、C均無顯著性影響，均為次要因素;因此，從節(jié)省時間及大生產的實際要求考慮，綠衣枳殼總黃酮的最佳提取工藝條件可定為A3B2C1D2，即用90%乙醇、1∶10的料液比、提取時間為1.5 h、提取次數(shù)為2次。

2.8 驗證試驗精確稱取3份綠衣枳殼藥材粗粉10.0 g，按照最佳工藝條件平行操作，A3B2C1D2進行試驗，結果總黃酮含量分別為60.914、60.788和60.915 mg/g;驗證的試驗結果表明本研究優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 總黃酮含量測定方法一般有NaNO2－Al(NO3)3－NaOH法、三氯化鋁比色法、堿比色法、直接測定法等。江周虹研究表明［5］，采用柚皮苷直接測定法作為枳殼中總黃酮的含量測定效果較好，故本試驗參考文獻中對于含有柚皮苷等類似成分的黃酮的紫外測定方法，選擇綠衣枳殼中含有的黃酮類成分柚皮苷［6］為指標成分，采用直接測定法對其進行總黃酮含量測定。

3.2 綠衣枳殼是本省大宗道地藥材之一，其主要黃酮類化合物為二氫黃酮類，有柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等，具有許多生理活性。因此，對其進行開發(fā)與利用，對促進地方經(jīng)濟發(fā)展、滿足地方用藥和外貿出口需要有十分現(xiàn)實的意義。

3.3 本研究提取工藝具有穩(wěn)定性好、總黃酮量高、操作簡便等優(yōu)點，為綠衣枳殼總黃酮的深度開發(fā)奠定了一定的基礎。

1黃堅航.福建綠衣枳殼的本草考證［J］.中藥材，2001，24(6):429－430

2李煌，張夢云.不同采收期綠衣枳殼中柚皮苷的含量測定［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(7):43－44

3徐優(yōu)曉，蘇孝共.枳殼理氣作用的臨床運用［J］.江西中醫(yī)藥，2005，36 (5):57－58

4潘馨，梁鳴.綠衣枳殼中揮發(fā)油的氣質聯(lián)析［J］.藥物分析雜志，2004，24(2):200－202

5江周虹.枳殼總黃酮的質量控制及腸吸收研究［D］.杭州:浙江大學，2007:4－6

6潘馨.綠衣枳殼中柚皮苷含量的測定方法的研究［J］.中南藥學，2005，3(2):82－83

R284

A

1006－5687(2014)02－0038－03

2014－01－13

福建省自然基金項目(No.2006F5053);陳可冀基金項目(No.CKJ2008084)