寇詠梅，賀江萍，郭曉霞

(1.天津市第二醫(yī)院，天津300141;2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

HPLC法測定涼血消風湯中綠原酸的含量*

寇詠梅1，賀江萍2，郭曉霞1

(1.天津市第二醫(yī)院，天津300141;2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070)

目的:建立高效液相色譜(HPLC)法測定涼血消風湯中綠原酸含量。方法:采用外標法。Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱為固定相，乙腈－0.4%磷酸溶液(13∶87)為流動相，檢測波長為327 nm，流速為1.0 ml/min。結(jié)果:線性范圍為4.0～40.0 μg/ml(r=0.999 1)，平均加樣回收率為101.0%，RSD為1.9%(n=6)。結(jié)論:本方法專屬性強，精密度和穩(wěn)定性良好，結(jié)果準確，可用于涼血消風湯的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜，綠原酸，涼血消風湯，含量測定

涼血消風湯是由生地、元參、白茅根、金銀花、生石膏、荊芥、防風、知母等11味中藥加工制成的中藥制劑，具有涼血清熱疏風的功效，用于風熱外襲、入里化熱的病機，治療脂溢性皮炎、蕁麻疹、玫瑰糠疹等癥。本院臨床應(yīng)用多年，效果較好。綠原酸作為金銀花的主要成分之一，也是涼血消風湯的主要有效成分，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用。為了完善涼血消風湯的質(zhì)量控制標準，以綠原酸作為定量指標具有重要意義。參考相關(guān)文獻［1－3］，本實驗建立了高效液相色譜法測定涼血消風湯中綠原酸的含量，為該方的質(zhì)量控制提供客觀的評價方法，同時也為該藥的劑型改進奠定了理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試藥綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110753－200413，供含量測定用);涼血消風湯(本制劑中心制備，批號120904、130401、130428);乙腈為色譜純;其他試劑均為市售分析純，重蒸水自制。

1.2 儀器6000 LDI型高效液相色譜儀(美國COMETRO公司)，6000PVW UV/VIS紫外檢測器(美國COMETRO公司)，EZChrom Elite分析工作站，AX205十萬分之一天平(瑞士梅特勒－托利多公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱Hypersil ODS2(250 mm× 4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈－0.4%磷酸溶液(13∶87);檢測波長:327 nm;流速:1.0 ml/min;柱溫: 30℃;進樣量:10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取對照品2.0 mg，置50 ml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml含40 μg的對照品溶液，10℃以下保存。

2.2.2 供試品溶液的制備取樣品適量，混勻，精密量取1 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，超聲處理5 min，放冷至室溫，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備根據(jù)處方組成，除金銀花外的其余藥味按制劑工藝制備，制得缺金銀花的陰性樣品。按“2.2.2”項下方法處理制得陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性按照“2.1”項下色譜條件，取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液10 μl分別進樣，在該色譜條件下，陰性樣品溶液在綠原酸峰的位置上沒有干擾，見圖1。

圖1 綠原酸對照品(A)供試品(B)陰性對照(C)HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系精密吸取綠原酸濃度為40 μg/ml的對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。按照“2.1”項下色譜條件分析，進樣10 μl，記錄峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標、濃度(X)為橫坐標進行線性回歸，得綠原酸的回歸方程分別為:Y=239 981X+ 34 149(r=0．999 1)，在4.0～40 μg/ml范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗精密量取對照品溶液10 μg/ml，按照“2.1”項下色譜條件分析，連續(xù)進樣6次，測得綠原酸峰面積，計算得其RSD為1.44%。

2.6 重復(fù)性試驗取同一批供試品溶液6份，按照“2.1”項下色譜條件分析，測得綠原酸峰面積為0.338 6 mg/ml，RSD為1.17%。

2.7 穩(wěn)定性試驗取同一批供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8和12 h進行測定，測得綠原酸峰面積為0.339 0 mg/ml，RSD為1.22%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗精密量取1 ml已知綠原酸含量0.338 2 mg/ml的供試品溶液6份，分別置50 ml量瓶中，精密加入0.338 mg對照品，按照“2.2.2”項下方法制備供試溶液，按照“2.1”項下色譜條件分析，計算其平均回收率101.0%，RSD為1.9%，結(jié)果見表1。

表1 綠原酸加樣回收率試驗結(jié)果

2.8 樣品測定取3批樣品，按“2.2.2”項下方法配制供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μl，按照“2.1”項下色譜條件分析，按外標法計算綠原酸含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

綠原酸經(jīng)紫外掃描可知，最大吸收波長為327 nm，故選擇最大吸收波長為檢測波長。綠原酸易溶于甲醇、乙醇，在提取過程中考查了以50%甲醇、80%甲醇、無水乙醇和稀乙醇為溶劑，分別進行超聲5 min和20 min、回流提取30 min，流動相乙腈－0.4%磷酸溶液(13∶87)、乙腈－0.1%磷酸溶液(10∶90)［4，5］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以50%甲醇超聲提取5 min即達到效果，樣品回收率高，并且方法簡便快捷，易于操作。

本制劑為復(fù)方制劑，成分較多，參照2010版《中國藥典》［6］以乙腈－0.4%磷酸溶液(13∶87)為流動相分離度較好，可用于涼血消風湯中綠原酸的定量分析。本研究將為涼血消風湯質(zhì)量標準的進一步完善提供科學(xué)依據(jù)。

1楊靜，高文遠.HPLC法測定乳瘡?fù)柚芯G原酸的含量［J］.天津藥學(xué)，2010，22(3):16－18

2余瓊，張玉萍，方步武.蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方中虎杖苷的含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，4(13):36－37

3李云貴，李沖，文翔昊，等.高效液相色譜法測定小兒肺熱咳喘口服液中綠原酸與木犀草苷的含量［J］.中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志，2013，41(4): 422－424

4薛士榮，李玉芳，孫燕燕.高效液相色譜法測定小兒清化丸中綠原酸和芍藥苷的含量［J］.天津藥學(xué)，2011，23(5):9－16

5丁兆猛.高效液相色譜法測定藍芩口服液中綠原酸和梔子苷的含量［J］.臨床合理用藥雜志，2011，4(13):36－37

6中國藥典［S］.一部.2010:205

Determination of chlorogenic acid in Liangxue Xiaofeng Tang by HPLC

Kou Yongmei1，He Jiangping2，Guo Xiaoxia1
(1.Tianjin Second Hospital，Tianjin 300141;2.Medical University of Tianjin，Tianjin 300070)

Objective:To establish an HPLC method for determination of chlorogenic acid in Liangxue Xiaofeng Tang.Methods: An external method with Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)column as fixed phase and acetonitrile－0.4%phosphoric acid(13∶87)as mobile phase was adopted.The detection wave length was 327 nm.The flow rate was 1.0 ml/min.Results:The linearity range was 4.0～40 μg/ml(r=0.999 1)，The average recovery was 101.0%，RSD was 1.9%(n=6).Conclusion:The method is simple，rapid and reliable.So it can be used as quantitativc determination for quality control of Liangxue Xiaofeng Tang.

HPLC，chlorogenic acid，Liangxue Xiaofeng Tang，determination

R927.2

A

1006－5687(2014)02－0020－02

2014－01－18