周建玉，王 衛(wèi)

(天津市藥品檢驗所，天津300070)

藥品質(zhì)量與檢驗

三合激素注射液含量測定方法的研究*

周建玉，王 衛(wèi)

(天津市藥品檢驗所，天津300070)

目的:采用高效液相色譜(HPLC)法測定三合激素注射液的含量。方法:色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇－水(80∶20)，流速:1.0 ml/min，柱溫:40℃，檢測波長為230 nm。結(jié)果:黃體酮在25～250 μg/ml濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性方程為A=1．84×104C+1．22×104，平均回收率為99．00%(n=9)，RSD為1.01%;丙酸睪酮在50～500 μg/ml濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性方程為A= 1．59×104C+2．25×104，平均回收率為98．18%(n=9)，RSD為0.97%;苯甲酸雌二醇在3.0～30.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性方程為A=2．5×104C－8．30×102，平均回收率為99．18%(n=9)，RSD為0.54%。結(jié)論:該方法簡便、精密、回收率高、重現(xiàn)性好，可用于三合激素注射液的含量測定。

高效液相色譜法，三合激素注射液，含量測定

三合激素注射液(tristerone injection)為復(fù)方制劑，其組分為每ml含苯甲酸雌二醇1.5 mg、黃體酮1.5 mg、丙酸睪酮25 mg，輔料為注射用油，臨床主要用于月經(jīng)不調(diào)、功能性子宮出血。三合激素注射液在國外藥典中均未收載，僅在國家標(biāo)準(zhǔn)［WS－10001－(0494)－2002］中收載?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用紫外顯色法測定丙酸睪酮與黃體酮的總量，沒有設(shè)定苯甲酸雌二醇的含量測定項，專屬性不強且不能準(zhǔn)確定量。在2010—2011國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高工作中，筆者著重對上述存在的問題進(jìn)行了考查，擬定了高效液相色譜(HPLC)法同時測定三個組分的含量，所建立的方法將收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器安捷倫Agilent 1200型高效液相色譜儀; Autoscience AS10200超聲儀;色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試劑和藥品苯甲酸雌二醇對照品(批號100006－200504，中國食品藥品檢定研究院);黃體酮對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100027－201208);丙酸睪酮對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100008－200505);甲醇(天津市康科德科技有限公司，色譜純)，水為純化水;三合激素注射液(A藥廠批號100405，規(guī)格為含苯甲酸雌二醇1.5 mg/ml、黃體酮1.5 mg/ml、丙酸睪酮25 mg/ml)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇－水(80∶20)為流動相;流速:1.0 ml/min，柱溫:40℃，檢測波長為230 nm。理論板數(shù)按黃體酮峰計算應(yīng)不低于4 000，黃體酮、丙酸睪酮和苯甲酸雌二醇峰之間的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 方法專屬性考查

2.2.1 高溫破壞試驗取三合激素注射液(玻璃安瓿瓶)置沸水中煮沸8 h后取出，放冷，量取1 ml，置100 ml量瓶中，按擬定標(biāo)準(zhǔn)處理后，作為待測溶液。

2.2.2 氧化破壞試驗量取三合激素注射液1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇適量搖勻后，加30%過氧化氫溶液1 ml，搖勻，室溫放置2 h，按擬定標(biāo)準(zhǔn)處理后，作為待測溶液。

2.2.3 光照破壞試驗取三合激素注射液(玻璃安瓿瓶)5支，在太陽光下照射20 d后，量取1 ml，置100 ml量瓶中，按擬定標(biāo)準(zhǔn)處理后，作為待測溶液。

2.2.4 酸破壞試驗量取三合激素注射液1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇適量搖勻后，加0.1 mol/L鹽酸甲醇溶液5 ml，搖勻，置水浴上放置30 min，放冷，用0.1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液調(diào)至中性，按擬定標(biāo)準(zhǔn)處理后，作為待測溶液。

2.2.5 堿破壞試驗量取三合激素注射液1 ml，置100 ml量瓶中，加甲醇適量搖勻后，加0.1 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液5 ml，搖勻，置水浴上放置30 min，放冷，用0.1 mol/L鹽酸甲醇溶液調(diào)至中性，按擬定標(biāo)準(zhǔn)處理后，作為待測溶液。

本研究應(yīng)用HPLC法檢測大鼠心衰實驗中不同給藥組動物心肌樣品，附子提取物組、山茱萸提取物組、附子+山茱萸提取物組與模型組比較其ATP（及其代謝產(chǎn)物 ADP、AMP）、PCr、creatinine等能量物質(zhì)均有不同程度升高，且附子+山茱萸提取物組比附子提取物組、山茱萸提取物組更為顯著，這一結(jié)果提示對于慢性心衰大鼠而言，附子+山茱萸聯(lián)合用藥較附子或山茱萸單用，更能有效提高心衰大鼠的心肌活性，其可能與藥物促使心肌組織更好的生成和使用ATP、PCr等能量物質(zhì)有關(guān)［5，7］。

2.2.6 專屬性試驗結(jié)果擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所選擇的色譜條件，能將三種成分主峰與苛刻條件下降解產(chǎn)生的雜質(zhì)峰進(jìn)行有效分離，專屬性較好，見圖1。

2.3 線性試驗分別稱取黃體酮對照品、丙酸睪酮對照品和苯甲酸雌二醇對照品各適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含1 250、2 500和300 μg的溶液，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液適量，分別置50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性試驗的系列溶液。按照確定的色譜條件，精密量取上述各溶液10 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)(C)，以相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(A)，進(jìn)行線性回歸。試驗結(jié)果表明，黃體酮在25～250 μg/ml濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性方程為A=1．84×104C+1．22×104(r=1，n=8);丙酸睪酮在50～500 μg/ml濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性方程為A=1．59×104C+2．25×104(r=1，n=8)。苯甲酸雌二醇在3.0～30.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性方程為A= 2．5×104C－8．30×102(r=1，n=8)。

圖1 高溫破壞(A)氧化破壞(B)光照破壞(C)酸破壞(D)堿破壞(E)高效液相色譜圖

2.4 回收率試驗按規(guī)格量的80%、100%和120%，分別稱取已知含量的丙酸睪酮、黃體酮和苯甲酸雌二醇原料藥適量，加注射用油溶解制成模擬樣品，每個濃度3份。按照確定的色譜條件，分別測定每個模擬樣品的含量，以測得藥量與加入藥量之比計算回收率。經(jīng)試驗，本方法平均回收率丙酸睪酮為98.18%(n= 9)，RSD為0.97%;黃體酮為99.00%(n=9)，RSD為1.01%;苯甲酸雌二醇為99.18%(n=9)，RSD為0.54%，結(jié)果見表1－3。

2.5 精密度試驗

2.5.1 系統(tǒng)精密度取對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，按黃體酮峰面積計算RSD，結(jié)果為0.1%;按丙酸睪酮峰面積計算RSD，結(jié)果為0.03%;按苯甲酸雌二醇峰面積計算RSD，結(jié)果為0.2%，表明該色譜系統(tǒng)精密度良好。

表1 黃體酮回收率試驗結(jié)果

表2 丙酸睪酮回收率試驗結(jié)果

表3 苯甲酸雌二醇回收率試驗結(jié)果

2.5.2 方法精密度精密量取樣品6份，按上述方法制備供試品溶液并進(jìn)樣測定含量，結(jié)果見表4。

表4 方法精密度試驗結(jié)果

2.6 定量限精密量取對照溶液適量，采取逐步稀釋法測定，本方法最低定量濃度黃體酮為1.39 μg/ml (S/N=10)，丙酸睪酮為2.62 μg/ml(S/N=10)，苯甲酸雌二醇為3.14 μg/ml(S/N=10)。

2.8 含量測定方法

2.8.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇－水(80∶20)為流動相;檢測波長為230 nm。理論板數(shù)按黃體酮計算應(yīng)不低于4 000，黃體酮、丙酸睪酮和苯甲酸雌二醇峰與相鄰峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.8.2 測定法用內(nèi)容量移液管精密量取本品適量(約相當(dāng)于黃體酮12.5 mg)，置100 ml量瓶中，加甲醇適量超聲溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻;取上述溶液置離心管中離心15 min(4 000 r/min)，取上清液作為供試品溶液，精密量取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖;另取黃體酮、丙酸睪酮和苯甲酸雌二醇對照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 ml中分別含黃體酮、丙酸睪酮和苯甲酸雌二醇125、250和15 μg的溶液，同法測定，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。

2.9 樣品測定樣品分別按本方法和法定方法測定含量，結(jié)果見表5。含量測定的色譜圖見圖2。

表5 含量測定新方法及原方法比較結(jié)果

圖2 對照品(A)供試品(B)陰性對照(C)HPLC色譜圖

3 討論

3.1 色譜條件的選擇參考《中國藥典》2010年版二部丙酸睪酮注射液、黃體酮注射液和苯甲酸雌二醇原料及注射液［1］標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合各成分紫外光譜最大吸收波長選擇色譜條件。由于處方中苯甲酸雌二醇的量最低，故根據(jù)以上條件選定擬定色譜條件:C18柱，甲醇－水(80∶20)，230 nm，溶劑:甲醇，見表6。

表6 色譜條件的種類

3.2 粗放度按照擬定方法測定一批樣品的含量，并進(jìn)行了耐用性試驗，各條件的測定結(jié)果基本一致，結(jié)果見表7。其中①島津LC－2010液相色譜儀，迪馬Diamonsil C18(2)柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);②Agilent 1200液相色譜儀，Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

表7 粗放度試驗結(jié)果

1中國藥典［S］.二部.2010:103，438，872

Content determination of tristerone injection by HPLC

Zhou Jianyu，Wang Wei
(Tianjin Municipal Institute for Drug Control，Tianjin 300070)

Objective:To establish a HPLC method to determine the content of tristerone injection.Methods:The Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column was adopted，the mobile phase was methanol－water(80∶20)，the flow rate was 1.0 ml/min，the column temperature was 40℃and detecting wavelength was 230 nm.Results:The mass concentration of progesterone in the range of 25～250 μg/ml(r=1，n=8)at the detecting wavelength of 230 nm had good linear correlation with the area of the test peak，the average recovery rate was 99.00%(n=9，RSD was 1.01%);The mass concentration of Testosterone in the range of 50～500 μg/ml(r=1，n=8)had good linear correlation with the area of the test peak，the average recovery rate was 98.18%(n=9，RSD=0.97%);The mass concentration of estradiol benzoate in the range of 3.0～30.0 μg/ml(r=1，n=8)had good linear correlation with the area of the test peak，the average recovery rate was 99.18%(n=9，RSD was 0.54%). Conclusion:The method is simple and precise with high recovery rate，high accuracy and good reproducibility，which can be used for the determination of the content of tristerone injection.

tristerone injection，content determination，HPLC

R927.2

A

1006－5687(2014)02－0014－04

2013－12－03

國家藥典委員會國家基本藥物標(biāo)準(zhǔn)提高課題(No.2010－780)