鄭 敏

(天津市北辰區(qū)藥品檢驗所，天津300400)

雙波長HPLC同時測定清營顆粒中綠原酸與甘草酸銨含量*

鄭 敏

(天津市北辰區(qū)藥品檢驗所，天津300400)

目的:建立HPLC法測定清營顆粒中綠原酸和甘草酸銨的含量。方法:采用高效液相色譜法，以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫;檢測波長為254 nm(甘草酸銨)和327 nm(綠原酸)，柱溫:40℃;流速:1.0 ml/min;進樣量:10 μl。結(jié)果:綠原酸在7.5～50 μg范圍內(nèi)線性良好(r=0．999 9，n=5)，甘草酸銨在4.5～30 μg范圍內(nèi)線性良好(r=0．999 9，n=5)，平均回收率分別為100.3%和100.5%，RSD分別為1.3%和1.6%。結(jié)論:本法操作簡便，重現(xiàn)性好，可有效控制該制劑質(zhì)量。

高效液相色譜法，清營顆粒，綠原酸，甘草酸銨

清營顆粒是本市某醫(yī)院制劑品種，該制劑由金銀花、赤芍、大黃、甘草等11味藥組成，具有清熱涼血、逐瘀消腫的功效。金銀花和甘草是該處方中的主要組分，其主要有效成分分別為綠原酸和甘草酸銨，該藥現(xiàn)有質(zhì)量標準無含量測定項，現(xiàn)采用雙波長HPLC同時測定清營顆粒中綠原酸和甘草酸銨雙組分的含量，該方法操作簡便，重現(xiàn)性好，可以有效控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器日本SHIMADZU LC－2010AHT高效液相色譜儀，LC solution工作站。色譜柱:DiamonsilTM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);賽多利斯BP211D電子天平;島津UV2450型紫外－可見分光光度計。

1.2 試藥綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110753－200413);甘草酸銨對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110731－201116)。樣品(本市某醫(yī)院提供，批號20130510、20130511、20130520;規(guī)格:10 g/袋)。甲醇、乙腈為色譜級;水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件流動相:以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫;檢測波長為254 nm(甘草酸銨)和327 nm(綠原酸)，柱溫為40℃，流速為1.0 ml/min，進樣量10 μl［1－3］。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應不低于3 000。

表1 梯度洗脫系統(tǒng)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液分別稱取綠原酸對照品和甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 ml含綠原酸25 μg/ml和甘草酸銨15 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取“裝量差異”項下的內(nèi)容物，研細，取約1 g，精密稱定，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理30 min(功率300 W，頻率40 kHz)，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液按處方比例及制法制成不含金銀花和甘草的陰性樣品，再按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液和混合對照品溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣，結(jié)果甘草酸銨與綠原酸分離度為17.1，符合《中國藥典》要求。結(jié)果見圖1。

2.4 標準曲線的制備取綠原酸和甘草酸銨對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml中分別含綠原酸7.638、12.73、25.46、38.19和50.92 μg及含甘草酸銨4.785、7.975、15.95、23.92和31.90 μg的混合溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，測定各自峰面積，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積值為縱坐標，求得綠原酸回歸方程:Y=39 471．3X+11 424．7(r= 0．999 9，n=5);求得甘草酸銨回歸方程Y=23 521．7 X+1 818．8(r=0．999 9，n=5)。結(jié)果表明綠原酸在7.638～50.92 μg范圍內(nèi)線性良好，甘草酸銨在4.785～31.9 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.5 精密度試驗取“2.2.1”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，連續(xù)進樣6次，分別測定對照品溶液中綠原酸和甘草酸銨峰面積，測得綠原酸RSD為0.33%，測得甘草酸銨RSD為0.24%，結(jié)果符合要求。

2.6 重現(xiàn)性試驗取同一批號(20130510)樣品“裝量差異”項下的內(nèi)容物，研細，取約1 g，精密稱定，共取6份，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法操作，按“2.1”項下色譜條件分析，測定每份樣品中綠原酸和甘草酸銨含量。結(jié)果樣品中綠原酸平均含量為0.699 mg，RSD為1.6%;甘草酸銨平均含量為0.383 mg/g，RSD為1.8%，結(jié)果均符合要求。

圖1 對照品(A)供試品(B)陰性對照(C)混合對照品(D)HPLC色譜圖

2.7 穩(wěn)定性試驗取同一批號(20130510)樣品裝量差異項下的內(nèi)容物，研細，取約1 g，精密稱定，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法操作，按“2.1”項下色譜條件分析，分別在0、2、4、6、8和10 h，測定樣品中綠原酸和甘草酸銨峰面積，測得峰面積值的RSD分別為0.27%和0.22%，說明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定，符合試驗要求。

2.8 回收率試驗取綠原酸對照品和甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為約含綠原酸0.15 mg/ml、甘草酸銨0.1 mg/ml的混合對照品溶液;另取不含金銀花與甘草的陰性樣品，研細，取約1 g，共9份，精密稱定，分別精密加入上述混合對照品溶液3.2、4.0和4.8 ml各3份，再加甲醇分別至25 ml，制得供回收率用供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，計算回收率，結(jié)果綠原酸平均回收率為100.3%，RSD為1.3%;甘草酸銨平均回收率100.5%，RSD為1.6%。符合試驗要求。結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗測定結(jié)果

2.9 樣品測定取3個批號的樣品，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法操作，按“2.1”項下色譜條件測定樣品中綠原酸和甘草酸銨含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 流動相的選擇選擇流動相時，分別比較了甲醇－水和乙腈－水不同比例的流動相系統(tǒng)，并加入適量磷酸改善峰形，結(jié)果以乙腈－0.1%磷酸溶液進行梯度洗脫，各個組分可以與相鄰雜質(zhì)峰分離完全，峰形較好。

3.2 檢測波長的選擇經(jīng)紫外光譜掃描，可以看到綠原酸在327 nm有最大吸收，甘草酸銨在254 nm有最大吸收，考慮到兩種成分沒有相近波長的最大吸收，故選用雙波長進行檢測。

3.3 提取方法和提取溶劑的考查試驗中分別采取加熱回流和超聲處理的提取方法，測定結(jié)果基本相同，為試驗操作方便簡捷，故將超聲提取定為本品提取方法。試驗中還分別采取70%乙醇、甲醇、50%甲醇為提取溶劑，結(jié)果顯示，提取溶劑使用單純的甲醇提取，含量測定結(jié)果較高;而采用加有水的甲醇和乙醇，測定結(jié)果較低，故本試驗提取溶劑定為甲醇。

1中國藥典［S］.一部.2010:80，205

2薛士榮，李玉仿，孫燕燕.高效液相色譜法測定小兒清化丸中的綠原酸和芍藥苷的含量［J］.天津藥學，2011，23(5):9－11，16

3楊靜，高文遠.HPLC法測定乳瘡丸中綠原酸的含量［J］.天津藥學，2010，22(3):16－17

R927.2

A

1006－5687(2014)02－0017－03

2014－01－02