尹立平，李文月

(天津市寶坻區(qū)藥品檢驗所，天津301800)

HPLC法測定阿莫西林有關(guān)物質(zhì)的測量不確定度評價*

尹立平，李文月

(天津市寶坻區(qū)藥品檢驗所，天津301800)

目的:對采用HPLC法測定阿莫西林有關(guān)物質(zhì)的測量不確定度進行評定。方法:建立數(shù)學(xué)模型，分析不確定度來源，量化不確定度各分量，合成不確定度，計算擴展不確定度。結(jié)果:阿莫西林有關(guān)物質(zhì)拓展不確定度U(Y單)=2× 5．76×10－5=1．15×10－4;U(Y總)=2×8．65×10－5=1．73×10－4。結(jié)論:拓展不確定度很小，阿莫西林有關(guān)物質(zhì)結(jié)果可信度高。

阿莫西林，HPLC法，測量不確定度評定

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)［1］，是評價測量水平的指標和判定測量結(jié)果質(zhì)量的依據(jù)。測量不確定度越小，測量結(jié)果的質(zhì)量越高。本文以HPLC法測定阿莫西林有關(guān)物質(zhì)為例，引入測量不確定度，進行分析評估，為評價測量結(jié)果的準確性提供可信依據(jù)［2－6］。

1 實驗

1.1 儀器與試藥島津LC－2010CHT高效液相色譜儀;梅特勒托利多天平AG 135;5 ml移液管，50和100 ml量瓶;阿莫西林對照品23.53 mg(中國藥品生物制品檢定所，批號130409－201011，含量:85.8%);阿莫西林膠囊(華北制藥股份有限公司，批號J1301202，規(guī)格:0.25 g);乙腈為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純。

1.2 色譜條件色譜柱:Agilent ZORBAX SB－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相A:0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(取0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用2 mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至5.0)－乙腈(99∶1);流動相B:0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)－乙腈(80∶20);檢測波長:254 nm;進樣量:20 μl;先以流動相A－流動相B(92∶8)等度洗脫，待阿莫西林峰洗脫完畢后立即按表1進行線性梯度洗脫。

表1 梯度洗脫系統(tǒng)

1.3 測定方法精密稱取阿莫西林膠囊內(nèi)容物0.203 5 g置100 ml量瓶中，加流動相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精取續(xù)濾液(2.0 mg/ml)20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖;另精密稱取阿莫西林對照品23.53 mg，置100 ml量瓶中，加流動相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml置50 ml量瓶中，用流動相A稀釋至刻度，搖勻(20 μg/ml)，精密量取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖;供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照品溶液主峰面積的1.0%，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照品溶液主峰面積的5.0%。

2 測量不確定度評估

2.1 數(shù)學(xué)模型

X%單=(At單×Ws×P×Vt)/(As×Wt×Vs)× 100%

X%總=(At總×Ws×P×Vt)/(As×Wt×Vs)× 100%

式中:

X%單—供試品中阿莫西林單個雜質(zhì)的百分含量

X%總—供試品中阿莫西林各雜質(zhì)和的百分含量

At單—供試品單個雜質(zhì)峰面積

At總—供試品中各雜質(zhì)峰面積和

As—對照品中阿莫西林的峰面積

Wt(s)—供試品(對照品)的稱樣量

Vt(s)—供試品(對照品)溶液的稀釋倍數(shù)

P—阿莫西林對照品的含量

2.2 測量不確定度的來源HPLC法測定阿莫西林有關(guān)物質(zhì)的不確定度來源主要有以下幾個方面:對照品稱重的相對標準不確定度U(Ws);對照品溶液稀釋玻璃量器引入的相對標準不確定度U(Vs);對照品峰面積引入的相對標準不確定度U(As);供試品稱重的相對標準不確定度U(Wt);溶液稀釋玻璃量器引入的相對標準不確定度U(Vt);供試品峰面積引入的相對標準不確定度U(At)。

2.3 不確定度各分量的量化

2.3.1 對照品稱重的相對標準不確定度U(Ws)

2.3.1.1 天平精度屬于B類不確定度。根據(jù)檢定證書天平精度d=0.01 mg，按矩形分布(k=31/2)計算，則標準不確定度U(Ws1)=0.01/31/2=5.77× 10－3。

2.3.1.2 稱量的重復(fù)性屬于A類不確定度。取對照品約23.5 mg，重復(fù)測定10次，結(jié)果為:23.60、23.56、23.49、23.50、23.52、23.54、23.49、23.57、23.53和23.50 mg。標準偏差S=0．04，則標準不確定度U(Ws2)=S/n1/2=0.04/101/2=1.26×10－2。

2.3.1.3 線性屬于B類不確定度。天平供應(yīng)商提供的線性為0.03 mg，按矩形分布(k=31/2)計算，則標準不確定度U(Ws3)=0．03∕31/2=1．73×10－2。減重稱量都是由相對獨立的2次稱量所得，故對照品稱重的相對標準不確定度U(Ws)=2×［U2(Ws1)+U2(Ws2)+U2(Ws3)］1/2/23．53=1．88×10－3。

2.3.2 對照品溶液稀釋過程玻璃量器引入的相對標準不確定度U(Vs)在對照品溶液逐級稀釋過程中，使用到了100 ml、50 ml量瓶和5 ml移液管，經(jīng)檢定為A級。有三方面因素。

2.3.2.1 玻璃量器校準屬于B類不確定度。容量允差:100 ml量瓶為±0.10 ml，50 ml量瓶為±0.05 ml，5 ml移液管為±0.015 ml，按矩形分布(k=31/2)，U (Vs1)={［0.1/(31/2×100)］2+［0.05/ (31/2×50)］2+［0.015/(31/2×5)］2}1/2=1.91× 10－3。

2.3.2.2 溫度玻璃量器校準溫度為20℃，實驗時溫度相差5℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10－4/℃，按矩形分布(k=31/2)，U(Vs2)={［(5×2.1×10－4×100)/ (31/2×100)］2+［(5×2.1×10－4×50)∕(31/2× 50)］2+［(5×2.1×10－4×5)∕(31/2×5)］2}1/2= 1.05×10－3

2.3.2.3 重復(fù)性屬于A類不確定度。在20℃室溫下，水的密度為1.002 85 g/ml，采用減重法，通過稱量水的重量測定量瓶及移液管的體積，重復(fù)5次測量得到數(shù)據(jù)如表1所示。

U(Vs3)={［(0．015∕(51/2×100)］2+［(0．005 3∕(51/2×50)2］+［(0．001 3∕(51/2× 5)2］}1/2=1．42×10－4。

U(Vs)=［U2(Vs1)+U2(Vs2)+U2(Vs3)］1/2= 2．18×10－3。

表1 _減重法測定量瓶及移液管的體積

2.3.3 對照品溶液色譜峰面積的相對標準不確定度U(As)來源有2個:①進樣重復(fù)性:屬于A類不確定度。取同一對照品溶液，連續(xù)進樣5次峰面積為: 68 752、68 799、68 819、68 909和68 882，計算峰面積的平均值為68 832，標準偏差S=63．42。U(As1)= (S/n1/2)/平均值=4.12×10－4。②系統(tǒng)影響:由于供試品溶液和對照品溶液是在相同條件下測定，故產(chǎn)生的系統(tǒng)偏差可被抵消。即U(As)=4.12×10－4。

2.3.4 供試品的稱量相對標準不確定度U(Wt)

2.3.4.1 天平精度屬于B類測量不確定度。根據(jù)檢定證書可知天平精度d=0.1 mg，按矩形分布(k= 31/2)計算，則標準不確定度U(Wt1)=0.1/31/2= 5.77×10－2。

2.3.4.2 重復(fù)性屬于A類測量不確定度。取供試品約0.200 g，重復(fù)測定10次，結(jié)果為:0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5、0.203 5和0.203 5 g。標準偏差S=0，則標準不確定度U(Wt2)=S/n1/2=0/101/2=0。

2.3.4.3 線性屬于B類測量不確定度。根據(jù)檢定證書所用天平示值誤差為0.2 mg，按矩形分布(k= 31/2)計算，則標準不確定度U(Wt3)=0．2∕31/2= 1．15×10－1。供試品稱重也是減重稱量為0.203 5 g，故供試品稱重的相對標準不確定度U(Wt)={2×［U2(Wt1)+U2(Wt2)+U2(Wt3)］1/2∕0．203 5×103= 0．016 5/0．203 5×103=1．26×10－3。

2.3.5 供試品溶液稀釋過程玻璃量器引入的相對標準不確定度U(Vt)測量不確定度分析同“2.3.3”項。供試品溶液稀釋過程中只用到100 ml量瓶，U (Vt)={［0.1∕(31/2×100)］2+［(5×2.1×10－4× 100)∕31/2×100)］2+［0.015∕(51/2×100)］2}1/2= 8.40×10－4。

2.3.6 供試品溶液色譜峰面積的相對標準不確定度U(At)供試品溶液重復(fù)進樣2次，按極差法計算(取n=2時，極差系數(shù)C=1．13，極差R1=最大峰面積－最小峰面積)，S=(R1/C)，U(At)=(S/n1/2)/平均值。①供試品溶液色譜圖中記錄最大雜質(zhì)色譜峰面積為33 622、32 369，平均值為32 995。R1=1 253，S= 1 108．85，U(At單)=2.38×10－2;②供試品溶液色譜圖中各雜質(zhì)峰面積和為:184 887、183 220，平均值為184 053。R2=1 667，S=1 475．22，U(At總)= (S/n1/2)/平均值=5．67×10－3。

2.4 合成相對標準不確定度Uc(Y)合成標準不確定度U單=［U2(P)+U2(Ws)+U2(Vs)+ U2(As)+U2(Wt)+U2(Vt)+U2(At單)］1/2=［(1.88×10－3)2+(2.18×10－3)2+(4.12× 10－4)2+(1.26×10－3)2+(8.40×10－4)2+(2.38× 10－2)2］1/2=2.40×10－2;

合成標準不確定度U總=［U2(P)+U2(Ws)+ U2(Vs)+U2(As)+U2(Wt)+U2(Vt)+ U2(At總)］1/2=［(1.88×10－3)2+(2.18×10－3)2+ (4.12×10－4)2+(1.26×10－3)2+(8.40×10－3)2+ (5.67×10－3)2］1/2=6.55×10－3。

Y單=［(32 995×23．53×10－3×85．8%×50)/ (68 832×0．203 5×100×50/5)］×100%=0．24%;

Y總=［(184 053×23．53×10－3×85．8%×50)/ (68 832×0．203 5×100×50/5)］×100%=1．32%。

合成相對標準不確定度Uc(Y單)=0．24%× 2．40×10－2=5．76×10－5;

合成相對標準不確定度Uc(Y總)=1．32%× 6．55×10－3=8．65×10－5。

2.5 擴展不確定度U(Y)U(Y)=K×UC(Y)，Y的可能值作正態(tài)分布估計，本實驗取包含因子K=2(置信概率為95%)，擴展不確定U(Y單)=2×5．76× 10－5=1．15×10－4;U(Y總)=2×8．65×10－5=1．73× 10－4。

2．6測量不確定度報告測量不確定度用Y±U(Y)表示，即X%單=0．24%±1．15×10－4(k=2);X%總= 1．32%±1．73×10－4(k=2)。

3 討論

阿莫西林的有關(guān)物質(zhì)測定采用單點外標法，環(huán)境溫度、濕度對質(zhì)量會帶來影響，其不確定度已納入稱量重復(fù)性中;對照品溶液進行測定時，在進樣、分離、檢測過程中，產(chǎn)生的隨機影響包括進樣體積重復(fù)性、泵流速穩(wěn)定性、分離重復(fù)性、檢測器穩(wěn)定性、積分變動性等，以上這些影響可合并為進樣重復(fù)性引入的不確定度。各項因素帶來的不確定度較小，說明本所檢驗室環(huán)境、檢驗儀器、檢驗人員操作等因素質(zhì)控較好，阿莫西林有關(guān)物質(zhì)含量結(jié)果可信度較高。

1國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.測量不確定度評定與表示［S］.JJFl059.1－2012

2中國合格評定國家認可委員會.化學(xué)分析中不確定度的評估指南［S］.CNAS－GL06.

3中國藥典［S］.二部.2010:402

4全國法制計量技術(shù)委員會.化學(xué)分析測量不確定度評定［S］. JJFl135－2005

5周燕，金佩芬，薛磊冰.HPLC法測定雙黃連膠囊中黃芩苷含量不確定度評定［J］.中國藥師，2011，14(2):221－223

6岑志芳，高衛(wèi)東.HPLC法測定健胃消食片中橙皮苷含量的測量不確定度分析［J］.中國藥房，2010，21(19):1786

R927.11

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1006－5687(2014)02－0024－03

2013－12－04