孫金旗++++++任艷萍++++++鞏姣梅

[摘要] 目的 評價酶法測定糖化血紅蛋白的可行性。 方法 酶法和離子交換高壓液相色譜分析法（HPLC法）同時檢測91例糖尿病患者的糖化血紅蛋白，對兩組數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。 結果 酶法與離子交換高壓液相色譜分析法的線性范圍分別是2.5%～15.5%和3.8%～18.5%，批內精密度分別是1.09%和1.17%，批間精密度分別是2.2%和2.8%，酶法測定糖化血紅蛋白的結果與離子交換高壓液相色譜分析法測定糖化血紅蛋白的結果相關性良好，線性方程y=1.0137x-0.072，R2=0.9886。酶法測定糖化血紅蛋白結果與HPLC法測定的結果差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 酶法與離子交換高壓液相色譜分析法有良好的相關性。酶法在全自動生化分析儀上檢測具有效率高、成本低的優(yōu)點，適合在臨床上推廣。

[關鍵詞] 糖化血紅蛋白；酶法；離子交換高壓液相色譜分析法

[中圖分類號] R446.11 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）09-0080-03

糖化血紅蛋白是血液中己糖（主要是葡萄糖）的糖基連接到蛋白質的氨基酸殘基而形成的。這是一個緩慢的、不可逆的非酶促反應，與血糖濃度和高血糖存在的時間相關[1]。持續(xù)的高血糖可增加血液中蛋白的糖化比例，蛋白質與葡萄糖結合后可發(fā)生變性，造成多器官功能衰竭，這是引起糖尿?。―M）慢性并發(fā)癥的一個原因[2，3]。因此，糖化血紅蛋白的檢測是一個十分重要的檢查項目。酶法作為可以在全自動生化分析儀上檢測的方法近年來在實驗室中得到推廣。本文采用可溯源至IFCC的糖化血紅蛋白檢測試劑盒，特異地測定源于HbA1c糖化二肽，與HPLC法的測定結果進行對比分析以確定酶法測定糖化血紅蛋白的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2013年1～6月本院內分泌門診與住院確診的糖尿病患者91例，診斷標準符合2010年ADA糖尿病標準化診療指南[4]。其中男55例，女36例，年齡37～75歲，平均55.1歲。排除貧血、低白蛋白血癥等影響糖化血紅蛋白測定的疾病。空腹靜脈抽血2 mL，EDTA-K2抗凝。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 酶法 日立全自動生化分析儀7600-020，糖化血紅蛋白測定試劑盒（二代酶法）、前處理液、校準品、質控品均由積水醫(yī)療科技（中國）有限公司提供。

1.2.2 離子交換高壓液相色譜分析法 伯樂D-10糖化血紅蛋白檢測系統(tǒng)（HPLC法）、糖化血紅蛋白檢測試劑包及質控品由美國伯樂公司提供。

1.3 方法

1.3.1 酶法 將全血標本離心，離心速度800×g，5 min[5]。吸取25 μL紅細胞加入500 μL前處理液，充分混勻后由日立全自動生化分析儀進行檢測。

1.3.2 離子交換高壓液相色譜分析法 全血混勻后依照伯樂公司提供的操作規(guī)程，利用D-10糖化血紅蛋白檢測系統(tǒng)進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。酶法和離子交換HPLC法的結果相關性采用線性回歸分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩樣本t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 線性分析

取一個高值樣本稀釋成如下比例（表1）：1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10、原倍。用兩種方法同時檢測后結果顯示：酶法線性范圍是2.5%～15.5%，R2=0.9920；離子交換HPLC法線性范圍是3.8%～18.5%，R2=0.9987。

2.2 精密度分析

酶法和HPLC法分別用各自公司提供的高、低水平的質控品進行精密度測試。同一批分析利用兩種方法測定質控品20次來確定批內精密度；每天測定一次，連續(xù)測定20 d來確定批間精密度。經(jīng)計算得到酶法的批內精密度CV 1.09%，批間精密度CV 2.2%；離子交換HPLC法的批內精密度CV 1.17%，批間精密度CV 2.8%。

2.3 相關性分析

分別用酶法和HPLC法同時檢測91例糖尿病患者的糖化血紅蛋白，以酶法為y，以HPLC法為x作線性相關性分析。線性回歸方程y=1.0137x-0.072，R2=0.9886（圖1）。酶法測定的糖化血紅蛋白結果與HPLC法差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表2）。

3 討論

糖尿病是一種由胰島素分泌缺乏或胰島素抵抗或兩者共同作用造成的以高血糖為特征的代謝性疾病[6]。糖尿病的慢性高血糖與各種組織的損傷臟器功能紊亂衰竭有關，特別是眼、腎臟、神經(jīng)、心臟和血管。長期的高血糖可導致多種并發(fā)癥的產(chǎn)生，尤其是病程長、病情控制差的糖尿病患者，后期往往會出現(xiàn)感染、糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病乳酸中毒、血管病變、神經(jīng)病變[7]。因此，監(jiān)測糖尿病患者的近期血糖水平尤為重要。糖化血紅蛋白作為一個能反映患者2～3個月的血糖平均水平恰好符合這一要求[8]。2002年美國糖尿病協(xié)會已將其作為檢測糖尿病血糖控制的“金標準”[9]。糖化血紅蛋白是血紅蛋白在體內與己糖發(fā)生緩慢的非酶促化學反應而形成的較為穩(wěn)定的化合物，而真正與葡萄糖發(fā)生結合的血紅蛋白為HbA1c，HbA1c由葡萄糖與HbA的β鏈纈氨酸殘基縮合而成，先形成一種不穩(wěn)定希夫堿，希夫堿解離或分子重排形成糖化血紅蛋白。

目前實驗室中檢測糖化血紅蛋白的常用方法有以下幾種：乳膠免疫比濁法、電泳法、高效液相色譜法（HPLC）、離子交換凝微柱層析法、酶法[10]。乳膠免疫比濁法是利用單克隆抗體或多克隆抗體特異識別纈氨酸β鏈N-末端糖化的血紅蛋白最后4～8個氨基酸組成的抗原表位進行分析測定，但是該方法的校準品得不到溯源，無法保證其準確性[11]。HPLC法作為檢測糖化血紅蛋白的參考方法具有良好的精密度和準確性，但是它檢測成本高并且需要專用昂貴的儀器，不易在臨床上推廣。酶法是近年來發(fā)展的一種簡便、快速、準確的方法[12]，它特異地測定源于HbA1c的糖化二肽，在特定的蛋白酶體系中與果糖基氨基酸反應，生成的過氧化氫使顯色劑呈現(xiàn)顏色。在全自動生化分析儀上可以通過特定波長檢測這種顏色度吸光度，吸光度的大小與顏色深淺成正比。endprint

王佑清等[13]在2012年報道酶法測定糖化血紅蛋白的線性范圍2.0%～16%，從本實驗結果來看，線性范圍與之接近。2010年ADA糖尿病標準化診療指南顯示：糖尿病的診斷標準之一是糖化血紅蛋白>6.5；糖尿病患者的糖化血紅蛋白控制目標是<7.0。本實驗室的酶法測定糖化血紅蛋白的線性范圍完全符合臨床的要求。對于>15.5%的檢測結果，可以在生化分析儀的參數(shù)里面直接設置稀釋比例進行復查。

有臨床組織頒布的指南建議將HbA1c是否下降0.5%來評判新的治療方案是否有效[14]，這就要求實驗室測定糖化血紅蛋白時有更高的精密度，才能保證糖尿病患者治療前后結果的可比性。酶法的精密度與檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性也有著密切的關系。全自動生化分析儀加樣系統(tǒng)的準確性、光路系統(tǒng)的穩(wěn)定性、清洗機構的清洗能力都會影響到酶法的精密度，應該定期對生化分析儀進行維護保養(yǎng)。另外酶法試劑裝載到儀器上之后會一直敞口放置，接觸空氣會使其有效成分發(fā)生改變。當室溫高于生化分析儀試劑倉的溫度時，瓶口凝結的水珠會流入試劑瓶稀釋試劑。當糖化血紅蛋白檢測完成時，可以把試劑擰緊蓋子放入冰箱。通過以上幾種方法使酶法測定糖化血紅蛋白處于最佳變異狀態(tài)，達到良好的精密度。本文的實驗結果表明酶法的批內精密度CV 1.09%，批間精密度CV 2.2%，酶法的批內和批間精密度均優(yōu)于HPLC法。

綜上所述，酶法測定糖化血紅蛋白精密度好，與HPLC法有良好的相關性，操作簡便，值得在臨床上推廣使用。

[參考文獻]

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[11] 趙翠伶，王麗娟，王連英，等. 不同糖化血紅蛋白檢測方法在臨床中的應用探討[J]. 中國醫(yī)刊，2013，48（8）：36.

[12] Keltanen T，Sajantila A，Valonen T，et al. Measuring postmortem glycated hemoglobin-A comparison of three methods[J]. Leg Med （Tokyo），2013，15（2）：72-78.

[13] 王佑清，喻飛，王生忠，等. 酶法測定糖化血紅蛋白的臨床應用[J]. 臨床和實驗醫(yī)學雜志，2012，11（9）：715-716.

[14] 宋銀丹，段勇. 糖化血紅蛋白檢測標準化的研究進展[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學，2013，31（2）：108-110，130.

（收稿日期：2013-12-05）endprint

王佑清等[13]在2012年報道酶法測定糖化血紅蛋白的線性范圍2.0%～16%，從本實驗結果來看，線性范圍與之接近。2010年ADA糖尿病標準化診療指南顯示：糖尿病的診斷標準之一是糖化血紅蛋白>6.5；糖尿病患者的糖化血紅蛋白控制目標是<7.0。本實驗室的酶法測定糖化血紅蛋白的線性范圍完全符合臨床的要求。對于>15.5%的檢測結果，可以在生化分析儀的參數(shù)里面直接設置稀釋比例進行復查。

有臨床組織頒布的指南建議將HbA1c是否下降0.5%來評判新的治療方案是否有效[14]，這就要求實驗室測定糖化血紅蛋白時有更高的精密度，才能保證糖尿病患者治療前后結果的可比性。酶法的精密度與檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性也有著密切的關系。全自動生化分析儀加樣系統(tǒng)的準確性、光路系統(tǒng)的穩(wěn)定性、清洗機構的清洗能力都會影響到酶法的精密度，應該定期對生化分析儀進行維護保養(yǎng)。另外酶法試劑裝載到儀器上之后會一直敞口放置，接觸空氣會使其有效成分發(fā)生改變。當室溫高于生化分析儀試劑倉的溫度時，瓶口凝結的水珠會流入試劑瓶稀釋試劑。當糖化血紅蛋白檢測完成時，可以把試劑擰緊蓋子放入冰箱。通過以上幾種方法使酶法測定糖化血紅蛋白處于最佳變異狀態(tài)，達到良好的精密度。本文的實驗結果表明酶法的批內精密度CV 1.09%，批間精密度CV 2.2%，酶法的批內和批間精密度均優(yōu)于HPLC法。

綜上所述，酶法測定糖化血紅蛋白精密度好，與HPLC法有良好的相關性，操作簡便，值得在臨床上推廣使用。

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王佑清等[13]在2012年報道酶法測定糖化血紅蛋白的線性范圍2.0%～16%，從本實驗結果來看，線性范圍與之接近。2010年ADA糖尿病標準化診療指南顯示：糖尿病的診斷標準之一是糖化血紅蛋白>6.5；糖尿病患者的糖化血紅蛋白控制目標是<7.0。本實驗室的酶法測定糖化血紅蛋白的線性范圍完全符合臨床的要求。對于>15.5%的檢測結果，可以在生化分析儀的參數(shù)里面直接設置稀釋比例進行復查。

有臨床組織頒布的指南建議將HbA1c是否下降0.5%來評判新的治療方案是否有效[14]，這就要求實驗室測定糖化血紅蛋白時有更高的精密度，才能保證糖尿病患者治療前后結果的可比性。酶法的精密度與檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性也有著密切的關系。全自動生化分析儀加樣系統(tǒng)的準確性、光路系統(tǒng)的穩(wěn)定性、清洗機構的清洗能力都會影響到酶法的精密度，應該定期對生化分析儀進行維護保養(yǎng)。另外酶法試劑裝載到儀器上之后會一直敞口放置，接觸空氣會使其有效成分發(fā)生改變。當室溫高于生化分析儀試劑倉的溫度時，瓶口凝結的水珠會流入試劑瓶稀釋試劑。當糖化血紅蛋白檢測完成時，可以把試劑擰緊蓋子放入冰箱。通過以上幾種方法使酶法測定糖化血紅蛋白處于最佳變異狀態(tài)，達到良好的精密度。本文的實驗結果表明酶法的批內精密度CV 1.09%，批間精密度CV 2.2%，酶法的批內和批間精密度均優(yōu)于HPLC法。

綜上所述，酶法測定糖化血紅蛋白精密度好，與HPLC法有良好的相關性，操作簡便，值得在臨床上推廣使用。

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[11] 趙翠伶，王麗娟，王連英，等. 不同糖化血紅蛋白檢測方法在臨床中的應用探討[J]. 中國醫(yī)刊，2013，48（8）：36.

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[13] 王佑清，喻飛，王生忠，等. 酶法測定糖化血紅蛋白的臨床應用[J]. 臨床和實驗醫(yī)學雜志，2012，11（9）：715-716.

[14] 宋銀丹，段勇. 糖化血紅蛋白檢測標準化的研究進展[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學，2013，31（2）：108-110，130.

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