河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011

Vav3對人胃癌細胞株BGC823血管生成基因的調(diào)節(jié)作用及意義

檀碧波 李勇 范立僑 趙群 王冬 劉羽

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011

背景與目的：研究發(fā)現(xiàn)Vav3基因在多種惡性腫瘤中表達異常，但Vav3與胃癌血管生成的關(guān)系尚不明確。本研究通過抑制內(nèi)源性Vav3，觀察其對胃癌細胞血管生成基因表達的影響，并探討其機制和意義。方法：熒光定量RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測人胃癌細胞株BGC823、胃上皮細胞株GES-1中Vav3的表達；合成針對Vav3的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，并轉(zhuǎn)染胃癌細胞株BGC823；MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后胃癌細胞的活性；檢測轉(zhuǎn)染前后BGC823血管生成相關(guān)基因血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)、VEGF-C、VEGF-D、血管生成素-2(angiogenin-2，Ang-2)、血管生成抑制蛋白-1(vasohibin-1)表達的變化。結(jié)果：Vav3在胃癌BGC823細胞中的表達明顯高于胃上皮細胞株GES-1(P＜0.01)；Vav3-siRNA轉(zhuǎn)染BGC823細胞后，Vav3表達明顯受到抑制(P均＜0.01)；MTT結(jié)果顯示Vav3-siRNA轉(zhuǎn)染后，BGC823活性明顯降低(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染后BGC823中VEGF-C和Ang-2表達均較轉(zhuǎn)染前降低(P均＜0.05)，而vasohibin-1表達則升高(P均＜0.05)。結(jié)論：Vav3對部分胃癌細胞血管生成相關(guān)基因有調(diào)控作用，并可能通過這種作用促進腫瘤血管生成。

胃癌；Vav3基因；血管生成；RNA干擾

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤，進展快，預(yù)后差，其重要原因在于胃癌具有較強的促進新生血管生成的能力［1-2］。但胃癌新生血管生成過程復(fù)雜，具體機制還不十分明確。Vav3作為原癌基因Vav家族成員之一，在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中扮演重要角色，且與腫瘤細胞的血管生成有關(guān)［3-4］。但Vav3調(diào)節(jié)胃癌血管生成的功能及具體機制還不明確。因此，本研究通過RNA干擾技術(shù)抑制人胃癌細胞株BGC823中Vav3表達，探討其調(diào)節(jié)腫瘤細胞血管生成的分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株和主要試劑

人低分化胃腺癌細胞株BGC823由本實驗室保種，正常胃上皮細胞株GES-1購自中國科學(xué)院上海細胞研究所。MTT購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；熒光定量RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；兔抗人Vav3、血管內(nèi)皮生長因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)、VEGF-C、VEGF-D、血管生成素-2(angiogenin-2，Ang-2)、血管生成抑制蛋白-1(vasohibin-1)及β-actin多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；相關(guān)PCR引物、小干擾RNA由上海生工生物工程公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

細胞置于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。實驗時將處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)消化分散后計數(shù)，制成細胞懸浮液備用。

1.3 Vav3-siRNA合成及轉(zhuǎn)染

Vav3特異性小干擾RNA(Vav3-siRNA)序列參考文獻［5］設(shè)計，序列為：5’-CCCAGUUUCU C U G U U U G A A G A A C A U-3’，無關(guān)對照siRNA(non-specific control siRNA，NS-siRNA)序列為5’-CCCUUCUCUGUUUGUAAAGAGACA U-3’。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，使用LipofectamineTM2000，按照說明書將Vav3-siRNA或?qū)φ誑S-siRNA轉(zhuǎn)染BGC823細胞株。

1.4 MTT法檢測細胞活性

BGC823細胞以5×104個/mL密度接種于96孔板，生長至60%～70%時轉(zhuǎn)染Vav3-siRNA或?qū)φ誷iRNA。每組設(shè)6個復(fù)孔。各實驗組于實驗結(jié)束前4 h加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT。培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，各孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩15 min，用酶標儀于波長490 nm處測吸光度(A)值。以上實驗重復(fù)3次。生長抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

1.5 熒光定量RT-PCR檢測目的基因mRNA表達

采用TRIzol一步法提取總RNA，取2 μg反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)以檢測靶分子的mRNA表達，GAPDH為內(nèi)參。按試劑盒說明建立終體積為20 μL的PCR反應(yīng)體系，2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Green Mix (Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。PCR熱循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)。應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物并經(jīng)過Blast比對檢測特異性后用于實驗。各基因引物序列：Vav3(81 bp)引物：正義鏈5’-CAAATTCACCGAGATCCTGT-3’，反義鏈5’-TGCTGGAGTGCTGTACGAAA-3’；VEGF-A(81 bp)引物：正義鏈5’-GCCTTGCCT TGCTGCTCTAC-3’，反義鏈5’-GATGATTCT GCCCTCCTCCTT-3’；VEGF-C引物(191 bp)：正義鏈5’-ACGAGCTACCTCAGCAAGA-3’，反義鏈5’-TTGTTCGCTGCCTGACACT-3’；V E G F-D引物(1 5 2 b p)：正義鏈5’-TCTCGCTCAGCATCCCATC-3’，反義鏈5’-CACCTCCACGCACGTTTCT-3’；A n g-2引物(3 2 9 b p)：正義鏈5’-CAAGACGGAACAACGAAC-3’，反義鏈5’-CACCGCTAACCAACCAAA-3’；Va s o h i b i n-1引物(1 2 8 b p)：正義鏈5’-CTGCCAATCAAATGCCTGGA-3’，反義鏈5’-AGCACGATGTGGCGGAAGTA-3’；G A P D H引物(1 3 8 b p)：正義鏈5’-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3’，反義鏈5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。RT-PCR檢測結(jié)果經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，RT-PCR檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法進行計算。GAPDH作為內(nèi)參照基因。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測各目的基因蛋白表達

提取樣本總蛋白，進行蛋白定量后，各取60 μg蛋白樣本上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST配制的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用稀釋后的目標分子一抗或內(nèi)參照β-actin一抗4 ℃溫育過夜，經(jīng)TBST漂洗3次后加相應(yīng)辣根過氧化酶標記的二抗室溫溫育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色，對條帶進行積分吸光度掃描。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Vav3在人胃癌細胞株BGC823中的表達

qPCR和Western blot結(jié)果均顯示人胃癌細胞株BGC823中Vav3表達明顯高于胃上皮細胞株GSE-1(P＜0.05，圖1)。

2.2 Vav3-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌BGC823細胞對Vav3表達的影響

Vav3-siRNA轉(zhuǎn)染BGC823細胞后，細胞中Vav3表達受到明顯抑制，本實驗中Vav3-siRNA在80 nmol/L、作用24 h時對Vav3抑制率達到90%左右。qPCR及Western blot驗證結(jié)果一致(P均＜0.01，圖2)。

2.3 Vav3-siRNA對BGC823細胞活性的影響

MTT結(jié)果顯示，Vav3-siRNA轉(zhuǎn)染后，BGC823細胞的存活率明顯下降，且存活率與濃度、時間呈依賴性(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染對照siRNA的對照組與陰性組相比，增殖抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖3)。

圖1 Vav3在BGC823細胞及GES-1細胞中的表達情況Fig. 1 Expression of Vav3 in gastric cancer cell line and gastric epithelial cell line

圖2 siRNA轉(zhuǎn)染對BGC823細胞Vav3表達的影響Fig. 2 Expression of Vav3 in BGC823 after Vav3-siRNA was transfected

2.4 Vav3-siRNA對BGC823細胞血管生成相關(guān)基因表達的影響

選取80 nmol/L的Vav3-siRNA、controlsiRNA分別轉(zhuǎn)染BGC823細胞24 h后檢測血管生成相關(guān)基因VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、Ang-2和vasohibin-1的表達情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后BGC823中VEGF-C、Ang-2表達均較轉(zhuǎn)染前降低(P均＜0.05)，而Vasohibin-1表達則升高(P均＜0.05)，VEGF-A、VEGF-D在轉(zhuǎn)染前后表達變化不明顯(P均＞0.05，圖4)。

圖3 Vav3-siRNA對BGC823細胞活性的影響Fig. 3 Effect of Vav3-siRNA to activity of BGC823 (MTT assay)

圖4 Vav3-siRNA對BGC823細胞血管生成相關(guān)基因的影響Fig. 4 Effect of Vav3-siRNA to angiogenesis related genes in BGC823 cells

3 討 論

新生血管形成是促進實體腫瘤侵襲進展的重要原因，采取措施抑制新生血管生成已成為腫瘤治療的熱點［6］。胃癌具有新生血管生成迅速的特點，這是胃癌進展快、預(yù)后差的主要原因之一［7-8］。故闡明胃癌血管生成機制有重要意義。雖然在此方面取得了許多成果，但具體機制仍不明確。報道顯示Vav3基因在胃癌中表達上調(diào)，與胃癌多種惡性生物學(xué)行為有關(guān)［9］，故本研究對胃癌細胞中Vav3的表達進行了探討，發(fā)現(xiàn)Vav3在胃癌細胞株表達較胃上皮細胞株高，說明Vav3可能參與了胃癌的發(fā)生及進展。siRNA抑制內(nèi)源性Vav3在胃癌BGC823細胞的表達后，細胞的增殖能力明顯下降，證實了Vav3對胃癌細胞活性有促進作用，可能作為今后治療的靶基因，值得進一步深入研究。

Vav3基因能通過調(diào)節(jié)Rho家族的不同成員活性參與對多條信號通路的調(diào)節(jié)作用［10-11］，Vav3通過這種功能可影響腫瘤細胞血管生成［4］。故本研究進一步從分子水平對Vav3受抑制后血管生成相關(guān)基因VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、Ang-2和vasohibin-1的變化進行了檢測。VEGF家族成員可以促進新生血管生成，與腫瘤進展關(guān)系密切［12-14］。Ang-2是血管生成素家族成員之一，可導(dǎo)致腫瘤新生血管形成［15］。而vasohibin-1則有抑制內(nèi)皮細胞生長和遷移的作用，對腫瘤新生血管的生成有抑制作用［16］。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vav3受抑制時促進細胞血管生成的VEGF-C、Ang-2的表達下調(diào)，而具有抑制腫瘤細胞血管生成作用的vasohibin-1基因表達則明顯升高。研究表明，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對VEGF家族成員有重要的調(diào)節(jié)作用［17］，而Vav3基因調(diào)控的下游主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，即為MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［18］，因此我們推測Vav3基因有可能通過調(diào)節(jié)MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性而影響了VEGF-C的表達。同時本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，抑制內(nèi)源性Vav3基因表達后VEGF-A、VEGF-D變化并不明顯，說明Vav3基因影響的僅是VEGF家族中的部分成員，具體的機制還有待深入研究。關(guān)于Vav3基因影響血管生成抑制基因vasohibin-1表達的機制目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道，我們推測Vav3基因可能也是通過對一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)而產(chǎn)生了這一效果。以上結(jié)果說明Vav3通過調(diào)節(jié)胃癌細胞血管生成網(wǎng)絡(luò)中部分成員表達而導(dǎo)致胃癌細胞血管生成能力的增強，但直接的分子間作用機制還有待深入。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，BGC 823細胞中Vav3表達上調(diào)，降低Vav3表達可調(diào)控部分血管生成相關(guān)基因表達。這些結(jié)果提示Vav3可能作為原癌基因在胃癌細胞血管生成過程中發(fā)揮了重要作用，有可能作為胃癌治療的新靶向基因。但本研究僅從分子水平進行了體外實驗，Vav3對胃癌血管生成的確切效果還有待進一步體內(nèi)研究予以證實。

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Effect and signi fi cance of Vav3 to angiogenesis of gastric cancer cell line BGC823

TAN Bi-bo, LI Yong, FAN Li-qiao, ZHAO Qun, WANG Dong, LIU Yu
(The Third Department of Surgery, the Fourth Af fi liated Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050011, China)

LI Yong E-mail: li_yong_hbth@126.com

Background and purpose: It was reported that Vav3 gene was expressed aberrantly in many cancers. But the relationship between Vav3 and angiogenesis genes of gastric cancer is still not clear. The purpose of this research was to investigate the effect and significance of Vav3 to angiogenesis of human gastric cancer cell line BGC823. Methods: The expressions of Vav3 in human gastric cancer cell line BGC823, gastric epithelial cell line GES-1 were tested by fluorecence quantitative RT-PCR and Western blot. Then Vav3-siRNA was synthesized and transfected into BGC823. Activity of BGC823 was measured with fluorecence quantitative RT-PCR and MTT assay. The expressions of angiogenesis related genes VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, angiogenin-1 (Ang-2), vasohibin-1 were determined by qPCR and Western blot. Results: Expressions of Vav3 were detected higher in gastric cancer BGC823 cells than in GES-1 (P＜0.01). Expression of Vav3 was inhibited by Vav3-siRNA (P＜0.05). Activity of BGC823 was obviously inhibited after Vav3-siRNA transfected with MTT assay (P＜0.05). The expressions of VEGF-C, Ang-2 were lower in cells after transfected by Vav3-siRNA(both P＜0.05); expression of Vasohibin-1 increased after Vav3-siRNA transfected into BGC823 (P＜0.05). Conclusion: Vav3 gene can regulate some angiogenesis related genes, and Vav3 may promote angiogenesis of gastric cancer cells with this fuction.

Gastric cancer; Vav3 gene; Angiogenesis; RNA interference

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.12.004

R735.2

A

1007-3639(2014)12-0901-05

2014-06-24

2014-08-07）

國家自然科學(xué)基金資助項目(81072033、81372580)；河北省自然科學(xué)基金資助項目(C2010000619)；河北省普通高校強勢特色學(xué)科資助項目(冀教高［2005］52)；河北省科技支撐項目(14277779D)；河北省衛(wèi)生廳重大醫(yī)學(xué)科研課題資助項目(zd2013040)。

李勇 E-mail:li_yong_hbth@126.com