璟

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

放射耐受性結(jié)腸癌細胞亞株的建立及其生物學(xué)特性

馮景璟肖然 盧仁泉 郭林

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

背景與目的：結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)的常見腫瘤，放療是其重要的治療手段之一。誘導(dǎo)并篩選具有放射耐受性的結(jié)腸癌細胞亞株，為研究結(jié)腸癌放射耐受的機制提供實驗?zāi)Ｐ?。方法：?yīng)用梯度遞增劑量的γ射線對SW620細胞株進行誘導(dǎo)照射，篩選得到放射耐受細胞亞株SW620/R。觀察細胞的形態(tài)變化和生長情況，通過CCK8法測定細胞增殖情況，流式細胞儀檢測細胞照射的周期及凋亡的變化，克隆形成實驗檢測細胞克隆形成率和放射敏感性。結(jié)果：通過照射劑量梯度遞增的誘導(dǎo)方法，成功建立了SW620/R細胞亞株。SW620/R細胞亞株形態(tài)與親本細胞明顯不同，并且在高劑量射線照射后仍能繼續(xù)生長；鑒定實驗顯示SW620/R細胞亞株與親本細胞相比倍增時間明顯延長，克隆形成率顯著下降；在細胞周期上S期的比例顯著上升，并且在照射后未出現(xiàn)周期的阻滯現(xiàn)象，同時發(fā)現(xiàn)其自發(fā)凋亡率顯著下降；克隆形成實驗顯示其放射耐受性明顯升高。結(jié)論：成功建立了放射耐受的細胞亞株SW620/R，經(jīng)鑒定其放射敏感性顯著降低，且兩者在增殖、克隆形成率、細胞周期和自發(fā)凋亡上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

結(jié)腸腫瘤；放射耐受；細胞周期；細胞凋亡

結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，2014年癌癥統(tǒng)計報告顯示其發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第3位［1］。其發(fā)病率在40歲開始上升，60～75歲時達到高峰，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。因此，其早期診斷、綜合治療和預(yù)后判斷一直是近年來的研究熱點。外科手術(shù)是治療結(jié)直腸癌的主要手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高。最近幾年來發(fā)現(xiàn)借助術(shù)前放療可提高根治性切除率，顯著降低局部復(fù)發(fā)率，可延長患者的生存時間［2］。本研究通過建立相關(guān)的放射耐受細胞亞株SW620/R，并且對其生物學(xué)特性進行研究，不但可以為研究結(jié)腸癌放射耐受發(fā)生機制提供理想的細胞模型，而且還能為結(jié)腸癌個體化放射治療奠定基礎(chǔ)［3］。

1 材料和方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌SW620細胞株購自ATCC，異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)染色試劑盒購自美國BD公司，CCK8試劑盒購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司，RPMI-1640、胎牛血清、胰蛋白酶及雙抗購自美國Gibco公司，流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，SARRP放療儀購自美國Gulmay公司，劑量率為350 cGy/min.。

1.2 細胞培養(yǎng)及放射誘導(dǎo)

培養(yǎng)親本SW620細胞株，待對數(shù)生長期的細胞匯合度達到70%～80%，給予初次3 Gy劑量射線的照射，待細胞生長至70%～80%匯合度，胰酶消化傳代進入對數(shù)生長期后(一般為3周)再次給予射線照射，同一劑量照射2次且每2次提高2 Gy照射劑量。

1.3 SW620/R與SW620細胞生長性狀的比較

培養(yǎng)對數(shù)生長期的2組細胞SW620和SW620/R，觀察2組細胞在顯微鏡下形態(tài)學(xué)上的差異。分別給予2組細胞一定劑量的照射，每隔一定時間鏡下觀察它們在形態(tài)學(xué)上的差異。

1.4 平板克隆形成實驗測定細胞克隆形成率

取對數(shù)生長期的SW620和SW620/R細胞，每孔接種100個細胞于6孔板上，10～14 d后終止培養(yǎng)。固定、染色后，顯微鏡下計數(shù)有效克隆數(shù)(超過50個細胞數(shù)的克隆為有效克隆)并計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=克隆數(shù)/實際接種細胞數(shù)×100%，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.5 CCK8法繪制細胞生長曲線

取對數(shù)生長期的SW620和SW620/R細胞，接種于96孔板上，每隔12 h加入10 μL CCK8作用3 h，于酶標儀以450nm波長測定吸光度(A)值，根據(jù)Patterson公式計算細胞的群體倍增時間(population doubling time，PDT)：PDT=(t-t0)lg2/ lgN-lgN0。

1.6 流式細胞術(shù)測定照射前、后細胞的周期和凋亡

取對數(shù)生長期的SW620和SW620/R細胞，待細胞匯合度達到50%～60%，給予9 Gy劑量射線的照射，在照射前和照射后24、72 h，分別消化離心收集2組細胞，用PBS洗滌。周期的測定：70%冷乙醇固定以及PI染色后，在流式細胞儀上分析并比較2組細胞照射前后的周期分布；自發(fā)凋亡率的測定：Annexin Ⅴ-FITC和PI染色后，在流式細胞儀上分析并比較2組細胞照射前后的自發(fā)凋亡率。

1.7 平板克隆形成實驗比較細胞放射敏感性

取對數(shù)生長期的SW620和SW620/R細胞，倍比稀釋后接種于6孔板上，根據(jù)細胞數(shù)目給予相應(yīng)的照射劑量，其后常規(guī)培養(yǎng)直至形成肉眼可見的克隆細胞。固定、染色后，顯微鏡下觀察克隆并計數(shù)。細胞的克隆形成率(plating efficiency，PE)和存活分數(shù)(surviving fraction，SF)分別按以下公式計算：PE=每孔克隆數(shù)/每孔細胞接種數(shù)×100%；SF=實驗組克隆形成率/對照組克隆形成率×100%。采用多靶單擊模型曲線［SF＝1-(1-e-Do/D)N］擬合2組細胞的劑量存活曲線，并求出相關(guān)的放射生物學(xué)參數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，細胞生長及存活曲線用Sigmaplot 10.0統(tǒng)計軟件擬合，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 放射耐受SW620/R細胞亞株的建立

放射耐受SW620/R細胞亞株通過梯度遞增照射劑量的誘導(dǎo)方法建立，分別在3、5、7和9 Gy劑量下各照射了2次，累計照射48 Gy的劑量。細胞株建立后繼續(xù)傳代培養(yǎng)4周，進行相關(guān)研究實驗。

2.2 SW620/R細胞亞株的形態(tài)學(xué)改變

觀察發(fā)現(xiàn)，SW620細胞株其細胞外形呈扁平梭形，細胞核圓形，位于細胞中央，細胞彼此間緊密相連；而SW620/R細胞亞株的形態(tài)學(xué)改變明顯，部分細胞呈不規(guī)則形態(tài)，細胞體積增大，細胞膜邊界不清，細胞內(nèi)的顆粒和空泡增多，偶見一些多核細胞(圖1)。

2.3 照射后SW620/R細胞亞株與親本細胞的生長情況

在9 Gy劑量的射線照射下，親本細胞SW620幾乎完全死亡，而SW620/R則能存活下來。照射2周后鏡下幾乎找不到貼壁的SW620細胞，而SW620/R僅出現(xiàn)了一定程度的凋亡和生長抑制，3周后鏡下僅能觀察到SW620的細胞碎片，而SW620/R則形成大量克隆分布在培養(yǎng)瓶中且已恢復(fù)生長狀態(tài)(圖2)。因此，可見相比親本細胞SW620/R對射線的敏感性明顯降低。

2.4 細胞克隆形成率的差異

SW620和SW620/R的克隆形成率分別為(73.33±4.16)%和(31.33±5.86)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.51，P＜0.05)，表明親本細胞的克隆形成能力明顯高于放射耐受細胞(圖3)。

圖1 SW620/R建立前、后的形態(tài)改變Fig. 1 Morphological changes of SW620/R before and after establishment

圖2 SW620/R和SW620照射后的生長情況Fig. 2 Growth of SW620/R and SW620 after illumination

2.5 細胞增殖能力比較

根據(jù)Patterson公式計算得到SW620和SW620/ R的PDT分別為(28.08±0.82)h和(39.37±1.78)h，延長約11.29 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.78，P＜0.05，圖4)。說明親本細胞SW620在增殖速度上明顯快于放射耐受細胞株。

圖3 SW620和SW620/R細胞染色后的鏡下克隆Fig. 3 Microscopic colony of SW620 and SW620/R after coloring

2.6 照射前、后SW620與SW620/R細胞的周期分布

圖4 SW620和SW620/R細胞生長曲線Fig. 4 Cell growth curve of SW620 and SW620/R

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，與照射前SW620相比，SW620/R細胞G0/G1期比例不變，S期比例增加，G2/M期比例減少(χ2=12.00，P＜0.05)。照射72 h后收集的2組細胞檢測周期可見，親本細胞周期在G0/G1期出現(xiàn)了明顯的周期阻滯，而SW620/R未出現(xiàn)明顯的細胞周期阻滯現(xiàn)象(圖5)。

圖5 SW620和SW620/R照射前、后細胞周期分布Fig. 5 Cell cycle distribution of SW620 and SW620/R before and after illumination

2.7 照射前、后SW620與SW620/R細胞的凋亡情況比較

經(jīng)統(tǒng)計比較發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下SW620與SW620/R的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(7.3% vs 2.4%，P＞0.05)，而照射9 Gy劑量射線72 h后檢測結(jié)果顯示SW620的凋亡率明顯高于SW620/ R(24.8% vs 8.3%)，可見照射一定劑量射線后，親本細胞的凋亡率顯著升高，放射耐受能力明顯不如耐受細胞株(圖6)。

2.8 平板克隆形成實驗檢測細胞放射敏感性

經(jīng)不同劑量的射線照射后，計算2組細胞的存活分數(shù)，觀察發(fā)現(xiàn)照射劑量達到7 Gy時，與親本細胞相比，SW620/R的放射敏感性顯著降低(t=22.44，P＜0.01)，2組細胞的存活分數(shù)采用單擊多靶模型進行擬合，劑量-效應(yīng)擬合曲線見圖7。SW620細胞擬合公式：SF=1-(1- e-D/1.06)18.15(R2=0.999 2，P＜0.05)；D0=1.06；N=18.15；Dq=1.33；SW620/R細胞擬合公式：SF=1-(1-e-D/1.19)22.62(R2=0.999，P＜0.05)；D0=1.19；N=22.62；Dq=1.61。

圖6 照射前、后SW620和SW620/R細胞的自發(fā)凋亡率Fig. 6 Spontaneous apoptosis of SW620 and SW620/R before and after illumination

圖7 SW620和SW620/R細胞存活曲線Fig. 7 Cell survival curve of SW620 and SW620/R

3 討 論

放療與手術(shù)切除的聯(lián)合治療在結(jié)直腸癌的治療中越來越受到重視，由于腫瘤細胞內(nèi)存在放射敏感性的差異，往往在同一放射治療條件下會產(chǎn)生不同的治療效果［4］。如果能夠闡明放射耐受形成的機制及放射耐受形成與照射劑量的關(guān)系，就能設(shè)計出相應(yīng)的解決方案，提高腫瘤治療的療效［5］。國內(nèi)、外已經(jīng)建立了多株放射耐受對比細胞模型［6-7］，并對其放射耐受機制做了初步的研究。本研究通過梯度遞增照射劑量的誘導(dǎo)方法成功建立了具有穩(wěn)定放射耐受能力的細胞亞株SW620/R，從而為進一步研究結(jié)直腸癌放射耐受機制提供了實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

已建立的放射耐受細胞亞株SW620/R進行傳代培養(yǎng)［8］，經(jīng)歷時間約為4周，此時生物學(xué)性狀基本穩(wěn)定。本研究結(jié)果顯示，SW620/R與其親本細胞SW620無論在細胞形態(tài)上，還是克隆形成能力以及細胞倍增時間上都存在顯著差異。通常情況下，增殖速度較快的細胞株具有更高的放射敏感性，反之，增殖速度較慢的細胞群體對射線相對不敏感［9］，這與實驗所得到的SW620在克隆形成和增殖能力方面明顯強于SW620/R的結(jié)論是一致的。

本研究采用多靶單擊模型進行細胞放射敏感性的分析［10］，從擬合2組細胞的生存曲線得到的放射學(xué)參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，相比其親本細胞，SW620/R的放射敏感性顯著降低，這與2組細胞在相同劑量射線照射后觀察細胞生長情況所得的結(jié)果(親本細胞幾乎完全死亡，放射耐受細胞繼續(xù)生長)也是一致的，從而進一步說明了所構(gòu)建的細胞株是具有一定放射抗拒性的［11］，并且該抗拒性能夠穩(wěn)定傳代。

已有研究表明，G2/M期細胞對射線最敏感，G1期細胞次之，S期細胞對射線最抗拒，如果不敏感期的細胞比例增加，那么細胞在射線照射時更有可能表現(xiàn)出抗拒性。本研究檢測2組細胞的周期后可以發(fā)現(xiàn)，在射線照射前，與親本細胞相比放射耐受細胞SW620/R的S期細胞比例明顯增加，而G2/M期細胞比例明顯減少，這與細胞凋亡實驗檢測得到的結(jié)果(親本細胞的自發(fā)凋亡率顯著高于耐受細胞)是一致的。因此，可以大膽推測放射耐受細胞株細胞S期細胞比例增加可能是其增強自身放射抗拒能力的一種途徑之一［12］。此外，G1期阻滯是p53表達陽性的細胞輻射后細胞周期的主要反應(yīng)，在本研究中，在射線照射后，p53表達陽性的親本細胞SW620出現(xiàn)了明顯的G1期阻滯現(xiàn)象，而放射耐受細胞SW620/R則未出現(xiàn)明顯的周期阻滯，這可能是兩者在p53的表達上有差異而引起的，因此，推測p53的表達可能與SW620/R的放射耐受機制相關(guān)，可以對其進行進一步的研究。

綜上所述，本研究通過梯度遞增照射劑量的誘導(dǎo)方法成功構(gòu)建了一株放射耐受細胞亞株SW620/R，該細胞亞株傳代4周后所進行的相關(guān)研究表明該細胞的放射抗拒能力是可以穩(wěn)定傳代的，并且推測該細胞S期細胞比例的增加可能是其產(chǎn)生放射抗拒能力的誘因之一，但是詳細的放射耐受產(chǎn)生機制需要進一步的研究。

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Establishment of radioresistant colorectal cancer cell-subline and its biological characteristics

FENG Jing-jing, XIAO Ran, LU Ren-quan, GUO Lin
(Department of Clinical Laboratory, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

GUO Lin E-mail: guolin500@hotmail.com

Background and purpose: Colorectal cancer is a common tumor of digestive system, radiation therapy is one of the important means of treatment. To explore the mechanism of colorectal cancer cell tolerated to radiation, radioresistant colorectal cancer cell-subline was induced and screened. Methods: Colorectal cancer SW620 cells were repeatedly given individual doses of γ-rays to induce radiation resistance. After monoclonal cells being selected and extensively cultured, the cell subline was named SW620/R. Morphological changes and growth of the cells before and after illumination were observed. Cell proliferation was tested by CCK8 assay. The distribution of cells in different stages of the cell cycle and apoptosis were investigated by fl ow cytometry. The relative radiosensitivities of tumor cells were assessed by standard colony formation assays. Results: SW620/R cells were established by gradient of increasing radiation dose induction method. SW620/R showed signi fi cant morphological changes compared with the parent strain SW620. Proliferation experiments showed SW620/R cell line doubling time was longer than SW620, clonogenic capacity decreased signi fi cantly. The resistant cells showed a higher percentage of cells in S phase and didn't appear cell cycle retardation, and the apoptosis rates were also found large differences between two cell lines after irradiation. SW620/R showed lower radiosensitivity by colony-forming assay. Conclusion: Radioresistant colorectal cancer cell subline SW620/R was established and it has lower radiosensitivity than the parental cell line. Two cell lines also have signi fi cant differences in proliferation, the rate of colony formation, cell cycle and spontaneous apoptosis (P＜0.05).

Colorectal cancer; Radiation resistance; Cell cycle; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.12.002

R735.3+5

A

1007-3639(2014)12-0889-06

2014-08-06

2014-09-08）

郭林 E-mail:guolin500@hotmail.com