蔡紅丹　張衡　劉權(quán)

摘要木質(zhì)素緊密結(jié)合在纖維素外層，由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和穩(wěn)定性，是纖維素資源利用中的一大障礙。目前微生物降解木質(zhì)素的研究主要集中在以白腐菌為代表的真菌上，細(xì)菌在木質(zhì)素降解中的作用有待研究。試驗(yàn)從洋蔥腐爛莖稈中取土樣，經(jīng)過堿木質(zhì)素為唯一碳源的限制性篩選和繼代培養(yǎng)，并以愈創(chuàng)木酚為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行顯色反應(yīng)，最終得到了一株具有木質(zhì)素分解能力的細(xì)菌。通過16S rDNA和gyrB基因測(cè)序?qū)υ摼赀M(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌屬于泛菌屬。與泛菌屬的植物病原菌不同，該細(xì)菌不具備致病性，可用于進(jìn)一步的木質(zhì)素的細(xì)菌分解以及纖維素的綜合利用研究。

關(guān)鍵詞木質(zhì)素；分解；泛菌

中圖分類號(hào)S182文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）09-02559-02

基金項(xiàng)目黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介蔡紅丹（1991- ），女，黑龍江大慶人，本科，專業(yè)：生物技術(shù)。*通訊作者，副教授，從事微生物資源利用研究。

木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元通過醚鍵和碳碳鍵連接而成的聚酚類三維網(wǎng)狀高分子芳香族化合物，在自然界中分布非常廣泛，主要存在于木本和草本植物的莖稈中。木質(zhì)素緊密包圍在纖維素的纖維外層，由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大，很難被微生物吸收利用，因此成為了纖維素資源利用中的一個(gè)障礙。

在自然界中，木質(zhì)素的微生物分解是由真菌、細(xì)菌等各種微生物群落共同作用的結(jié)果[1]。目前，木質(zhì)素的微生物分解研究主要集中在以白腐真菌為代表的真菌上。白腐真菌能夠分泌胞外氧化酶降解木質(zhì)素，包括木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、錳過氧化物酶（Manganesedependent peroxidase，MnP）和漆酶 （Laccase），因此被認(rèn)為是最主要的木質(zhì)素降解微生物[2-3]。雖然此類真菌具有較好的分解效果，但若要將其應(yīng)用到去除纖維素外層的木質(zhì)素的生產(chǎn)應(yīng)用中，存在2個(gè)嚴(yán)重問題：一是白腐真菌的生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶量低，難以放大到工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用；二是白腐真菌在分解木質(zhì)素的同時(shí)必須以纖維素為碳源維持自身生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致降解木質(zhì)素的同時(shí)也降解纖維素，達(dá)不到纖維素資源有效利用的目的。因此，有必要尋找其他途徑來實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的快速分解和纖維素的有效利用。

細(xì)菌降解木質(zhì)素的能力較真菌差，但是由于細(xì)菌的生長(zhǎng)周期短，易于培養(yǎng)，適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。此外，在木質(zhì)素的降解過程中，細(xì)菌發(fā)揮了一些關(guān)鍵性作用，如支鏈的改性、環(huán)開裂和解聚等。因此，細(xì)菌在木質(zhì)素分解中的作用也不容忽視[4-5]。在細(xì)菌分解木質(zhì)素的研究中，發(fā)現(xiàn)了一部分對(duì)木質(zhì)素有降解效果的細(xì)菌，主要包括鏈霉菌（Streptomyces）、節(jié)桿菌（Arthrobacter）、小單孢菌（Micromonospora）等放線菌，還有假單胞菌（Pseudomonas）、黃桿菌（Flavobacterium）等非絲狀細(xì)菌[6-8]。這些細(xì)菌能夠分解不同聚合形態(tài)的木質(zhì)素，在木質(zhì)素降解的不同階段發(fā)揮作用。此外，有一些研究報(bào)道了這些菌株能夠分泌一些過氧化物酶類，可以對(duì)木質(zhì)素的一種人工聚合形式——硫酸鹽木質(zhì)素進(jìn)行降解[9]。這說明細(xì)菌在降解木質(zhì)素的過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，針對(duì)細(xì)菌對(duì)木質(zhì)素降解的研究值得進(jìn)一步開展。筆者針對(duì)以上問題，開展了能夠分解木質(zhì)素的細(xì)菌的篩選工作，并通過16S rDNA和gyrB基因測(cè)序?qū)υ摼赀M(jìn)行鑒定，以期為分解木質(zhì)素的細(xì)菌的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料從洋蔥腐爛莖稈中取樣，經(jīng)過堿木質(zhì)素為唯一碳源的限制性篩選和繼代培養(yǎng)，并經(jīng)過愈創(chuàng)木酚為唯一碳源的顯色反應(yīng)，最終得到一株具有木質(zhì)素分解能力的細(xì)菌，

1.2方法

1.2.1微量元素混合液。FeCl3·6H2O 0.16 g，ZnSO4·7H2O 1.5 g，CoCl2·6H2O 0.16 g，CuSO4·5H2O 0.15 g，MnSO4·H2O 1.5 g，H3BO3 0.3 g，Na2MoO4·2H2O 0.1 g，蒸餾水定容至1 L，使用前使用0.22 μm濾器過濾除菌。

1.2.2初次選擇培養(yǎng)基。堿木質(zhì)素 1.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 0.1 g，微量元素混合液1.0 ml，蒸餾水定容至1 L，pH 5.0，121 ℃下濕熱滅菌30 min。

1.2.3 2次選擇培養(yǎng)基。愈創(chuàng)木酚 1.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 0.1 g，微量元素混合液1.0 ml，蒸餾水定容至1 L，pH 5.0，121 ℃下濕熱滅菌30 min。

1.2.4LB固體平板。蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 15 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0，121 ℃下濕熱滅菌30 min，冷卻后倒入培養(yǎng)皿。

1.2.5目的菌株的篩選。從洋蔥腐爛莖稈中取土樣1.00 g，加入含有玻璃珠的200 ml三角瓶中，加蒸餾水50 ml，于150 r/min振蕩1 h，靜置5 min，取懸浮液以10%的接種量加入到100 ml初次選擇培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)液以10%的接種量加入到100 ml初次選擇培養(yǎng)基中，循環(huán)培養(yǎng)5次。

取懸浮培養(yǎng)液涂布到LB固體平板上，37 ℃倒置靜止培養(yǎng)24 h，得到布滿單克隆的平板。挑取不同外觀的克隆接種到5 ml的2次選擇培養(yǎng)基中，26 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，觀察顏色反應(yīng)，培養(yǎng)液顏色變?yōu)樽霞t色的即為目的菌株。取目的菌株的懸浮培養(yǎng)液涂布到LB固體平板上，37 ℃倒置靜止培養(yǎng)24 h，單克隆的目的菌株。

1.2.6目的菌株的鑒定。為了對(duì)該菌株進(jìn)行分子鑒定，使用細(xì)菌16S rDNA 引物對(duì)該菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為：784F（AGGATTAGATACCCTGGTA） 和1061R （CGACACGAGCTGA- CGAC）。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，44個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，其余PCR產(chǎn)物通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，連同引物送交華大基因測(cè)序。

為了進(jìn)一步鑒定該菌株，針對(duì)Pantoea ananatis的gyrB基因的保守區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。上游引物為GGTGGTATCCGTACAAGTA，下游引物為GAAACGCCTCGTTCTTGC。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃，30 s，50 ℃，30 s，72 ℃，30 s，44個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，其余PCR產(chǎn)物通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，連同引物送交華大基因測(cè)序。將該菌株的16S rDNA和GyrB基因序列利用NCBI Blast數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1目的菌株的獲得試驗(yàn)從洋蔥腐爛莖稈中取樣，經(jīng)過堿木質(zhì)素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)后，得到4種不同外觀的克??；將這4種克隆分別加入愈創(chuàng)木酚為唯一碳源的2次選擇培養(yǎng)基后，僅有1種克隆發(fā)生了顏色反應(yīng)，使培養(yǎng)液顏色變?yōu)樽霞t色。經(jīng)過初步的生理鑒定，該菌株為革蘭氏陰性菌，菌落外觀形態(tài)為圓形，顏色為不透明乳白色，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后會(huì)呈現(xiàn)黃色（圖1）。

3結(jié)論與討論