侯貞秀，李 哲

心肌細(xì)胞在缺氧／復(fù)氧過(guò)程中有不同程度的自噬參與。在缺氧／復(fù)氧的不同階段，自噬所起的作用不同。在缺氧期，自噬主要起保護(hù)作用，而復(fù)氧期則主要起損傷作用［1，2］。如何通過(guò)抑制自噬降低缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞的死亡，提高其存活率，是目前研究的熱點(diǎn)［3］。本文采用體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，建立缺氧／復(fù)氧模型，模擬在體缺血／再灌注損傷過(guò)程，從基因水平上觀察心肌細(xì)胞在缺氧／復(fù)氧過(guò)程中給予維拉帕米后對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。為缺血／再灌注心肌細(xì)胞的進(jìn)一步治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)自博研（上海）生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑 鹽酸維拉帕米注射液購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司；胎牛血清購(gòu)自四季青，浙江天杭生物科技有限公司；DMEM 購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；Trizonal購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；PCR 引物由生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)；3－MA 購(gòu)自selleckchem 公司；連二亞硫酸鈉購(gòu)自sigma公司；DMSO 購(gòu)自sigma公司；MTT（四氮唑藍(lán)）Amresco公司；SYBR 染料購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。主要儀器，LS－B50L型立式壓力蒸氣滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠L－550型臺(tái)式低速大容量離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；倒置顯微鏡：上海電子儀器廠二氧化碳培養(yǎng)箱：Heraeus公司；德國(guó)AB104－N 型電子天平：上海電子儀器廠；SW－CJ－2F超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司Q－PCR儀：美國(guó)BIO－RAD公司。

1.3 乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞復(fù)蘇后置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)，隔天用D－Hanks液為心肌細(xì)胞換液，生長(zhǎng)至約80%時(shí)，傳代培養(yǎng)，采用第3代～4代心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 建立缺氧／復(fù)氧模型及實(shí)驗(yàn)分組 缺氧／復(fù)氧模型的建立［4］：采用連二亞硫酸鈉化學(xué)法，用D－Hanks液將其配成濃度為18g／L，分裝，置－20℃冰箱中保存，臨用時(shí)稀釋成終濃度為5mmol／L，加入DMEM 培養(yǎng)液中，制成缺氧液。用缺氧液換用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)1h，模擬缺氧過(guò)程，再換用正常DMEM 培養(yǎng)液（復(fù)氧液）培養(yǎng)4h，模擬復(fù)氧過(guò)程。將培養(yǎng)第3代～4代傳代心肌細(xì)胞隨機(jī)分為5組，空白對(duì)照組：正常DMEM 培養(yǎng)基＋胎牛血清培養(yǎng)；缺氧／復(fù)氧組［4］：將DMEM 培養(yǎng)液換成缺氧液培養(yǎng)1h，再換用復(fù)氧液培養(yǎng)4h，即為缺氧／復(fù)氧處理。缺氧／復(fù)氧＋3－MA 組：在缺氧液中加入終濃度為5mmol／L［5］的3－MA 培養(yǎng)1h［6］，再換用終濃度為5mmol／L的3－MA 復(fù)氧液培養(yǎng)4h。缺氧／復(fù)氧＋維拉帕米組：在缺氧液中加入終濃度為1mg／L 的維拉帕米培養(yǎng)1h，再換用終濃度為1mg／L的維拉帕米復(fù)氧液培養(yǎng)4h。缺氧／復(fù)氧＋3－MA＋維拉帕米組：在缺氧液中加入終濃度為1mg／L的維拉帕米與終濃度為5mmol／L 的3－MA 共同培養(yǎng)1h，再換用含終濃度為1mg／L 的維拉帕米與終濃度為5 mmol／L的3－MA 復(fù)氧液共同培養(yǎng)4h。

1.5 MTT 法檢測(cè)心肌細(xì)胞的存活率［7］采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞（第3～4代心肌細(xì)胞），按上述分組方法進(jìn)行分組，然后0.25%胰酶消化后用DMEM 培養(yǎng)液調(diào)成濃度為約5×104／mL的單細(xì)胞懸液，分配至96板孔中，每孔約100μL，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸棄上清液，加入MTT 工作液（5g／L），每孔約10μL；37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)基，加入每孔200μLDMSO 終止反應(yīng)，置于搖床上輕微震蕩10min。在酶標(biāo)儀570nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A 值。細(xì)胞存活率（survival rate SR）：SR／%＝（A 實(shí)驗(yàn)組／A 對(duì)照組）1）100%。

1.6 RT－PCR法檢測(cè)Beclin－1、LC－3mRNA及Bcl－2mRNA的表達(dá) 采用Trizonal試劑法按照Trizonal試劑說(shuō)明提取總RNA。MJ PCR 儀進(jìn)行PCR 反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄液：總RNA2μL，RNAase Free dH2O 6μL，總量10μL，共配5 份；反轉(zhuǎn)錄程序：37℃15 min 85℃5s4℃1h，cDNA 置于1 mL EP 管中。RT－PCR 反應(yīng)液體系：Template 2μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，21）mix 10μL，ddH2O 7.2μL，總體積20μL，共配體系20份?？傮w系配好后，用槍吸打均勻，54μL 每份中加入6μL 模板，分裝至8連管中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)采用β－actin作為內(nèi)參，置于qPCR 儀中，程序：94℃30s，94℃5s，60℃30s，95℃1h，55℃1h，55℃20s，共擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響 與正常對(duì)照組相比，缺氧／復(fù)氧組心肌細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），與缺氧／復(fù)氧組相比，維拉帕米組，3－MA 組，維拉帕米組＋3－MA 組心肌細(xì)胞存活率均增高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 5組心肌細(xì)胞存活率的比較

表1 5組心肌細(xì)胞存活率的比較

與空白對(duì)照比較，1）P＜0.05；與H／R 組比較，2）P＜0.05；與維拉帕米組比較，3）P＜0.05

?

2.2 Beclin－1、LC－3 及Bcl－2mRNA 的 表 達(dá) RT－PCR 結(jié) 果 顯示：與 空 白 對(duì) 照 組 相 比，缺 氧／復(fù) 氧 組Beclin－1、LC－3 mRNA表達(dá)量均上調(diào)（P＜0.0 5），Bcl－2mRNA的表達(dá)下降（P＜0.05）；3－MA 組，維拉帕米組及3－MA 組＋維拉帕米組Beclin－1、LC－3mRNA 表 達(dá) 量 均 下 降（P ＜0.05），3－MA 組，維 拉 帕米組及3－MA組＋維拉帕米組Bcl－2mRNA的表達(dá)增加（P＜0.05）。與缺氧／復(fù)氧組相比，3－MA 組，維拉帕 米組，3－MA組＋維拉帕米組Beclin－1、LC－3mRNA表達(dá)量均下降（P＜0.05），維拉帕米組及3－MA 組＋維拉帕米組Bcl－2mRNA表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05），3－MA 組Bcl－2mRNA 無(wú)明顯變化。詳見(jiàn)表2。

表2 3種基因的值比較

表2 3種基因的值比較

與空白對(duì)照比較，1）P＜0.05；與缺氧復(fù)氧組比較，2）P＜0.05；與3－MA＋維拉帕米組比較，3）P＜0.05

組別Beclin－1 Bcl－2 LC－3空白對(duì)照組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00缺氧復(fù)氧組 3.48±0.021） 0.74±0.021） 3.14±0.071）3－MA 抑制劑組 1.87±0.021）2）3）0.77±0.031）3） 2.05±0.041）2）3）維拉帕米組 0.59±0.021）2）3）1.79±0.031）2）3）1.71±0.021）2）3）3－MA＋維拉帕米組 0.69±0.021）2） 2.37±0.031）2）1.55±0.021）2）F 值 11 999.16 2 345.03 1 411.94 P 0.001 0.001 0.001

3 討 論

近年來(lái)，與傳統(tǒng)死亡方式凋亡相比，人們更加關(guān)注Ⅱ型程序性死亡方式自噬［8］。自噬的發(fā)生是首先形成自噬體，然后自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后降解其所包裹的內(nèi)容物。其中，自噬發(fā)生的重要環(huán)節(jié)在于自噬體的形成［9］。自噬體的形成需要多種自噬相關(guān)基因（Atg）的參與［9］，如：Beclin－1（酵母Atg6的同源），Atg5，Atg16，Atg，12，Atg8（LC－3的同源）等。雷帕霉素通路（mTOR 通路）及Bcl－2／Beclin－1通路是兩條熟知的自噬信號(hào)調(diào)節(jié)通路。在自噬體調(diào)節(jié)過(guò)程中，Atg12－Atg5－Atg16可與LC－3及Atg9一起被轉(zhuǎn)運(yùn)至自噬泡，參與自噬泡的擴(kuò)展。同時(shí)，磷脂酰激酶3（PI3K）可與Beclin1結(jié)合，形成復(fù)合體負(fù)責(zé)調(diào)控自噬體膜的凝集，并包裹蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)復(fù)合體及細(xì)胞器。Bcl－2／Beclin－1 通 路 中，Bcl－2 可 通 過(guò) 結(jié) 合 并 抑 制PI3K復(fù)合體的重要組成成分Beclin－1來(lái)抑制這一過(guò)程。而3－MA 作為一種非特異性的PI3K 抑制劑，參與抑制自噬體形成的過(guò)程［10］。

在細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)過(guò)程中，許多刺激因子均可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬，如營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺血、缺氧、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等。缺氧／復(fù)氧損傷可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣超載，而鈣離子拮抗劑維拉帕米可通過(guò)拮抗鈣超載從而保護(hù)心肌細(xì)胞［11］。

自噬在缺氧／復(fù)氧過(guò)程中的調(diào)節(jié)起“雙刃劍”作用。在缺氧過(guò)程中，通過(guò)Beclin－1、Atg5，LC－3等的上調(diào)激活自噬，起保護(hù)作用，而在再灌注過(guò)程中，自噬測(cè)過(guò)度表達(dá)則影響細(xì)胞的存活率。

本實(shí)驗(yàn)成功建立體外缺氧／復(fù)氧模型，模擬在體缺血再灌注損傷過(guò)程。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度維拉帕米對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率影響不同，表明濃度為1mg／L 的維拉帕米較其他濃度對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞存活率高。提示適宜濃度維拉帕米預(yù)處理可發(fā)揮對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。而自噬抑制劑3－MA 在 復(fù) 氧 時(shí) 使 用，使Beclin－1、LC－3 mRNA 表 達(dá)量下降，同時(shí)，提高了細(xì)胞的存活率，而維拉帕米使Bcl－2 mRNA 表達(dá)量增加，Beclin－1、LC－3 mRNA 表達(dá)量下降，自噬抑制劑3－MA 合用維拉帕米可使Bcl－2 mRNA 表達(dá)量增加，與單用維拉帕米差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Beclin－1、LC－3 mRNA 表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明維拉帕米可能通過(guò)Bcl－2／Beclin－1通路抑制LC－3的表達(dá)，提高缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞的存活率，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。維拉帕米處理對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，推測(cè)Bcl－2／Beclin－1 通路在其保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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