李詠，韓梅芳，師愛(ài)超，丁琳，陸玉蕾，張?jiān)獊啠鹾昶G，寧琴

·實(shí)驗(yàn)性肝炎·

MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎小鼠肝臟和慢加急性肝衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR2表達(dá)的變化*

李詠，韓梅芳，師愛(ài)超，丁琳，陸玉蕾，張?jiān)獊?，王宏艷，寧琴

目的研究慢性乙型肝炎患者和慢加急性乙型肝炎肝衰竭（HBV-ACLF）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）Toll樣受體2 （TLR2）表達(dá)，以及鼠三型肝炎病毒（MHV-3）誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎小鼠肝臟TLR2表達(dá)的變化。方法收集慢性乙型肝炎和HBV-ACLF患者外周血，分離PBMC，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)PBMC中TLR2 mRNA；給Balb/cJ小鼠腹腔注射MHV-3（100 pfu），建立小鼠暴發(fā)性肝炎模型，觀察感染0、24、48和72 h后肝臟TLR2水平變化。結(jié)果BALB/cJ小鼠在感染MHV-3后，與0 h[（0.39±0.06）%]比，肝細(xì)胞TLR2 mRNA水平在感染48和72 h均顯著升高[分別為（9.06±1.60）%和（6.42±2.42）%，P＜0.05）]，并于48 h達(dá)最高水平，且兩時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞TLR2 mRNA水平均與血清ALT和AST水平呈正相關(guān)（r=0.804，P＜0.01；r=0.797，P＜0.01）；HBV-ACLF患者PBMC 中TLR2 mRNA水平顯著高于慢性乙型肝炎患者[（5.92±5.26）% 對(duì)（1.15±1.59）%，P＜0.05）]。結(jié)論TLR2參與了MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎小鼠以及HBV-ACLF患者肝臟損傷的發(fā)病過(guò)程。

暴發(fā)性肝炎；慢加急性肝衰竭；鼠三型肝炎病毒；Toll樣受體2；小鼠

Toll樣受體在天然免疫和后天免疫中都起著至關(guān)重要的作用，可以識(shí)別病原微生物表達(dá)的保守結(jié)構(gòu)基因序列[1]。很多TOLL受體的信號(hào)途徑是通過(guò)髓樣分化蛋白MyD88介導(dǎo)的[2]。TOLL樣受體的激活可促進(jìn)相關(guān)炎癥和抗炎因子的釋放，激發(fā)機(jī)體對(duì)病原微生物產(chǎn)生防御反應(yīng)[3]。Toll樣受體2（Toll-Like receptor 2/TLR2）是TLR家族中的重要成員之一，主要是識(shí)別各種病原微生物，如革蘭氏陽(yáng)性菌、螺旋體和支原體等[4]，而TLR2、3、5與自身免疫性肝炎和酒精性肝病[5]發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TLR4的激活會(huì)促進(jìn)炎性細(xì)胞的聚集，產(chǎn)生與炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子[6]?？偟膩?lái)說(shuō)，不同的TLR的激活可以導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不同的抗細(xì)菌或病毒的相關(guān)免疫反應(yīng)機(jī)制。肝衰竭仍是危害人們健康的疾病之一，并發(fā)癥較多，且病死率較高[7]。雖然近年來(lái)取得的一些進(jìn)展在一定程度上改善了患者預(yù)后，但肝衰竭的致病機(jī)制尚未完全闡明。目前主要認(rèn)為免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活導(dǎo)致大量炎性因子的釋放可能是導(dǎo)致肝衰竭發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。TLR2在肝衰竭發(fā)病中的作用尚未完全闡明。本研究使用鼠三型肝炎病毒（MHV-3）誘導(dǎo)的小鼠肝衰竭模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)暴發(fā)性肝炎小鼠肝組織TLR2水平，同時(shí)檢測(cè)了慢性乙型肝炎輕度和乙型肝炎病毒導(dǎo)致的慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）TLR2表達(dá)的變化，以探討TLR在肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 病毒株MHV-3病毒株為本研究室保存，經(jīng)DBT細(xì)胞系空斑純化，利用鼠17CL1細(xì)胞系繁殖培養(yǎng)，采用鼠L2細(xì)胞系蝕斑純化和滴度測(cè)定。本研究所使用的MHV-3滴度為1×106pfu/ml。

1.2 肝衰竭模型的建立取雌性SPF 級(jí)Balb/cJ小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物飼養(yǎng)在本實(shí)驗(yàn)室潔凈層柜（IVC 系統(tǒng)，蘇州馮氏公司）內(nèi)，恒溫、恒濕，自由食水。MHV-3 以無(wú)菌生理鹽水重懸配置，制備感染液。以腹腔注射方式感染小鼠，每只小鼠腹腔注射200 μl 感染液（100 PFU /只）。對(duì)照組以無(wú)菌生理鹽水以同等劑量注入小鼠腹腔。

1.3 肝組織TLR2 mRNA檢測(cè)取肝組織50～100 mg，于1 ml Trizol中碾磨,按Trizol法提取RNA，分光光度計(jì)定量，電泳。采用南京金斯瑞公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄，取RNA 1 μg，加入OligodT 1 μl，雙蒸水補(bǔ)足至12 μl，70℃水浴10 min，冰上冷卻，再依次加入：逆轉(zhuǎn)錄混合緩沖液4 μl，1 mmol/L dNTP 1 μl，RNA酶抑制劑2 μl，37℃水浴5 min，后加入逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，42℃水浴60 min，70℃10 min，滅活終止反應(yīng)，cDNA置于-20℃保存。采用Real-Time PCR法檢測(cè)目的基因：自NCBI基因庫(kù)選取小鼠GAPDH、MyD88和TLR2基因，采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，引物由北京擎科公司合成，引物序列如下：小鼠GAPDH，上游；5'-CTCATGACCACAGTCCATGCCATC-3'，下游5'-CTGCTTCACCACCTTCTTG-3'；小鼠TLR2，上游5'-GGGAGCGGCGGCTGGAGGACTCCTA-3'，下游5'-AGGTCGCAGAGACTGCCGTCCAACC-3'；小鼠MyD88，上游5’-GCACCTCAGTACACACA-3’,下游5’-TGATGATAGAACTCTTCCACT-3’；人β-actin，上游5'-CCAACCGCGAGAAGATGA-3'，下游5'-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3'；人TLR2，上游5’-GCGTTCTCTCAGGTGACTGCTCG-3',下游5'-CAGTGAAAGAGCAATGGGCACAA-3'。PCR反應(yīng)體系為20 μl,采用日本TOYOBO公司試劑盒（QPK201-T），包括上下游引物各1 μl,模板1 μl,SYB 10 μl,加雙蒸水補(bǔ)足至20 μl。反應(yīng)條件為95℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃35 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4 患者PBMC中TLR2 mRNA檢測(cè)本研究經(jīng)同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)?；颊吆炇鹬橥鈺?shū)。選擇的16例慢性肝炎輕度（男11例，女5例，平均年齡36歲）和17例HBV-ACLF患者（男15例，女2例，平均年齡43歲）的診斷均符合2000年西安會(huì)議修訂的病毒性肝炎防治方案[8]。取外周血，應(yīng)用Ficoll密度離心法分離，分離PMBCs，用Trizol裂解，提取RNA，采用Real-Time PCR法檢測(cè)TLR2 mRNA水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行資料分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用ANOVA方差分析或者t檢驗(yàn)，采用線性回歸分析。P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 MHV-3誘導(dǎo)的Balb/cJ小鼠暴發(fā)性肝炎模型建立成功接受100 pfu MHV-3腹腔注射的10只Balb/cJ小鼠在72 h全部死亡，而接受生理鹽水處理的10只小鼠全部存活。

圖1 MHV-3感染小鼠肝組織MyD88 mRNA水平顯著升高

2.2 MHV-3誘導(dǎo)的Balb/cJ小鼠肝組織MyD88 mRNA水平變化與0 h比，小鼠肝組織MyD88 mR NA水平在48 h顯著升高[（1.85±0.07）% 對(duì)（9.90± 2.11）%，P＜0.05，圖1]。2.3 MHV-3誘導(dǎo)的Balb/cJ小鼠肝組織TLR2 mRNA水平變化結(jié)果表明，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，與0 h比，感染48 h和72 h時(shí)小鼠肝組織TLR2 mRNA水平顯著升高[分別為（0.39±0.06）% 對(duì)（9.06± 1.60）%，P＜0.05和（6.42±2.42）%，P＜0.05，圖2]，于感染48 h達(dá)到高峰。

圖2 MHV-3感染小鼠肝組織TLR2mRNA水平顯著增高

2.4 MHV-3感染小鼠肝組織TLR2 mRNA水平與血清ALT和AST水平變化密切相關(guān)結(jié)果顯示，在感染72 h，小鼠肝組織TLR2 mRNA水平與血清ALT或AST水平呈正相關(guān)（圖3）。

圖3 MHV-3誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎小鼠肝組織TLR2 mRNA水平與血清ALT和AST水平的關(guān)系（r=0.804，P＜0.01；r=0.797，P＜0.01）

2.5 慢性乙型肝炎輕度和HBV-ACLF患者PBMC中TLR2 mRNA水平變化結(jié)果顯示，與慢性乙型肝炎輕度患者比，HBV-ACLF患者PBMC中TLR2 mRNA水平顯著升高[（5.92±5.26）% 對(duì)（1.15±1.59）%，P＜0.05，圖4]。

圖4 慢性乙型肝炎輕度與HBV導(dǎo)致的慢加急性肝衰竭患者PBMC中TLR2 mRNA水平比較

3 討論

慢性肝衰竭占我國(guó)肝功能衰竭患者總數(shù)的90%。肝衰竭起病快，往往伴隨多種并發(fā)癥，例如腹水、肝性腦病、肝腎綜合征和嚴(yán)重感染等，致死率高。該病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明。主要觀點(diǎn)普遍認(rèn)為免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活導(dǎo)致促炎性因子的大量釋放，進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞的損傷，全身多器官功能衰竭，最終導(dǎo)致患者死亡[9，10]。Toll樣受體和免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，Toll樣受體可能在急性肝衰竭中起到重要作用。因此，深入研究TLR與免疫損傷的關(guān)系，對(duì)深入了解肝衰竭的致病機(jī)制有非常重要的意義。

肝臟中的Toll受體通過(guò)門(mén)靜脈以及相關(guān)分支能夠接觸到相應(yīng)病原體成分，通過(guò)激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而廣泛參與肝臟的生理病理過(guò)程。近幾年來(lái)，TLRs在肝臟疾病，如病毒性肝炎、酒精性肝病及脂肪性肝病中的作用正被逐步揭示出來(lái)。Isogawa et al研究發(fā)現(xiàn)，活化的TLR5、TLR7、TLR9能夠在24小時(shí)內(nèi)通過(guò)IFN-α/β依賴(lài)途徑抑制HBV復(fù)制[11]。Manigold et al發(fā)現(xiàn)TLR2在內(nèi)毒素血癥的肝硬化患者PBMC中表達(dá)上調(diào)[12]，而TLR4在Child-Pugh A級(jí)肝硬化患者PBMC中顯著下調(diào)[13]，提示TLRs可能參與了肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

本研究發(fā)現(xiàn)，在未感染的小鼠中，TLR2的表達(dá)非常低，但在感染MHV-3后，TLR2在48小時(shí)和72小時(shí)明顯上調(diào)，且在48小時(shí)達(dá)到峰值。MyD88依賴(lài)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路?，F(xiàn)有資料表明TLR2、3、4、7、9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)均通過(guò)該途徑完成。在我們的研究中，MyD88和TLR2表達(dá)的變化基本是一致的，都是在48小時(shí)開(kāi)始升高，之后回落，提示在感染早期，這一通路起到重要作用。在MHV-3感染小鼠肝衰竭模型中，肝衰竭小鼠TLR2有顯著升高，與肝衰竭患者PBMC中TLR2的高表達(dá)有相似之處，提示可以用小鼠肝衰竭模型在一定程度上模擬肝衰竭患者，為以后更進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。

TLRs表達(dá)與外來(lái)配體的刺激有密切關(guān)聯(lián)，TLR2作為與病毒感染關(guān)系較為密切的一種模式識(shí)別受體，其表達(dá)和病毒的感染可能存在一定的相關(guān)性，它可以在外界病毒入侵的早期就開(kāi)始表達(dá)上調(diào)[4，14，15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在病毒感染的初期TLR2迅速被激活。隨著炎癥的不斷進(jìn)展，TLR2在48小時(shí)達(dá)到高峰，并于72小時(shí)緩慢回落，但仍顯著高于基線水平。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TLR2在MHV-3感染后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)與小鼠血清ALT和AST水平呈正相關(guān)。TLR可以通過(guò)激活NF-KB和MAPK通路，促進(jìn)T細(xì)胞增殖和激活，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6的釋放[14，16，17]。炎性細(xì)胞因子的激活被認(rèn)為在肝衰竭損傷的病理生理中起到重要作用[18～21]，而激活的細(xì)胞因子反過(guò)來(lái)又可以繼續(xù)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞上TLR表達(dá)。本研究表明TLR2在肝臟損傷的致病過(guò)程中起到了重要的作用。有研究表明，在小鼠體內(nèi)注射氨基半乳糖和脂質(zhì)體聯(lián)合注射后，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中的TLR2 mRNA水平表達(dá)有增高，提示TLR2有可能參與了氨基半乳糖和脂質(zhì)體誘導(dǎo)的肝衰竭[17]，而我們的研究結(jié)果與此發(fā)現(xiàn)類(lèi)似。在外來(lái)病毒或者細(xì)菌感染過(guò)程中，肝細(xì)胞損傷可能是過(guò)度激活的免疫應(yīng)答所導(dǎo)致的。TLR2啟動(dòng)的炎性應(yīng)答對(duì)控制病毒感染可能有限, 但在致死性單純皰疹病毒性腦炎中卻起重要作用。Kurt-Jones et al在單純皰疹病毒腦炎中證實(shí)，TLR2 是主要的識(shí)別受體，其啟動(dòng)的炎性應(yīng)答有助于病毒清除, 但同時(shí)也造成嚴(yán)重的組織損傷[22]。

本研究在HBV-ACLF患者和慢性乙型肝炎輕度患者發(fā)現(xiàn)TLR2均有表達(dá),但是在慢性乙型肝炎輕度患者其表達(dá)明顯偏低。我們的結(jié)果與以往的研究有相似之處[23]。由于慢性乙型肝炎輕度患者病情比較穩(wěn)定,在長(zhǎng)期慢性化過(guò)程中，炎癥反應(yīng)較弱, 因此體內(nèi)TLRs未被大量激活,免疫損傷相對(duì)較輕，而慢性肝衰竭患者多由慢性肝炎急性進(jìn)展而來(lái)。因此，TLR2被大量激活，同時(shí)也造成一定程度的免疫損傷。我們推論,TLR2在慢性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的作用可能通過(guò)如下途徑實(shí)現(xiàn): 在發(fā)病早期通過(guò)TLR2對(duì)病毒成分的識(shí)別而激活免疫應(yīng)答系統(tǒng)，促進(jìn)相關(guān)炎性因子如IL-6、TNF-α、INF-γ的釋放。在感染過(guò)程中，隨時(shí)間的推移，肝臟炎癥不斷進(jìn)展，TLR2對(duì)宿主的損傷作用還可能與后期釋放內(nèi)毒素有關(guān)。因此，在肝功能衰竭發(fā)病機(jī)制中TLR2的上調(diào)既參與了病毒的防御識(shí)別，也參與了肝衰竭的致病過(guò)程。

通過(guò)本研究我們認(rèn)為：TLR2在肝衰竭發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，TLR2在肝衰竭中的作用將為研究乙型肝炎重癥化的發(fā)病機(jī)制開(kāi)拓新的領(lǐng)域。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究不斷進(jìn)展，TLR2在肝衰竭中的具體作用會(huì)不斷被闡明，未來(lái)可能為肝衰竭的靶向治療提供新的思路和研究手段。

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（收稿：2014-01-24）

（校對(duì)：陳從新）

TLR2 in liver tissues of mice with MHV-3-induced fulminant hepatitis and in peripheral blood mononuclear cells from patients with hepatitis B virus associated acute-on-chronic liver failure

Li Yong，Han Meifang，Shi Aichao，et al.Department and Institute of Infectious Disease，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan，400030，Hubei Province，China

Objective To investigate the toll-like receptor 2 （TLR2）in livers of mice with murine hepatitis virus-3 （MHV-3）-induced fulminant hepatitis and in peripheral blood mononuclear cell （PBMCs）from patients with mild chronic hepatitis B（CHB）or with HBV-associated acute-on-chronic liver failure （HBV-ACLF）. Methods PBMCs from patients with mild CHB and HBV-ACLF were collected. The TLR2 mRNA in PBMCs were determined by quantitative real-time PCR. Balb/cJ mice were injected intraperitoneally with MHV-3 at dose of 100 pfu to induce fulminant hepatitis. At 0，24，48 and 72 h after injection，the TLR2 mRNA in liver tissues of mice were determined. Results After infection of MHV-3，TLR2 mRNA increased significantly at 48 and 72 h when compared with the baseline at 0 h [（0.39±0.06）% vs.（9.06±1.60）%，P＜0.05 and （6.42±2.42）%，P＜0.05] and it peaked at 48 h；mRNA levels for TLR2 at 48 and 72 h were positively correlated with the serum ALT and AST（r=0.804，P＜0.01；r=0.797，P＜0.01，respectively）；mRNA level of TLR2 in PBMCs from patients with HBV-ACLF was significantly higher than patients with mild CHB [（5.92±5.26）% vs.（1.15±1.59）%，P＜0.05]. ConclusionsTLR2 may take part in the process of liver injury in MHV-3-induced fulminant hepatitis in mice and the pathogenesis of patients with HBV-ACLF.

Fulminant hepatitis；Acute-on-chronic liver failure；Murine hepatitis virus-3；Toll-like receptor 2；Mouse

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.011

教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：IRT1131）

430030 武漢市華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染性疾病研究所/感染病科（李詠，韓梅芳，師愛(ài)超，丁琳，張?jiān)獊?，王宏艷）；廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（陸玉蕾）

李詠，男，32歲，博士研究生。主要從事病毒性肝炎發(fā)病機(jī)制研究。E-mail:vamos_yong@hotmail.com

寧琴，E-mail:qning@vip.sina.com