張瑩，孔賀利，張建軍，劉梅，任鋒，劉霜，陳煜，段鐘平，鄭素軍

shRNA重組慢病毒沉默SMAD3對大鼠肝纖維化的抑制作用*

張瑩，孔賀利，張建軍，劉梅，任鋒，劉霜，陳煜，段鐘平，鄭素軍

目的觀察SMAD3 shRNA重組慢病毒對大鼠肝纖維化的影響。方法隨機(jī)將Wistar大鼠60只分為生理鹽水對照組（20只）、shRNA對照組（20只）和SMAD3 shRNA組（20只）。對shRNA對照組和SMAD3 shRNA組大鼠，通過脾臟注射法給予慢病毒1.0×108TU/只，生理鹽水對照組則給予等體積500μl生理鹽水，給藥1w后開始制備大鼠四氯化碳肝纖維化模型。在造模4w和8w時，采用Real-Time PCR法檢測肝組織SMAD3表達(dá)；采用ELISA 法檢測血清I型和III型膠原水平。結(jié)果在造模4w和8w時，與生理鹽水對照組和shRNA對照組比，SMAD3 shRNA組肝組織SMAD3 mRNA水平顯著降低（4w:P=0.000，P=0.001；8w:P=0.001，P=0.009）；肝組織學(xué)檢查顯示，在造模4w和8w時，SMAD3 shRNA組大鼠肝纖維化程度減輕；在造模4w時，SMAD3 shRNA組動物血清I型膠原[（3.33±1.60）ng/ml]和III型膠原[（1.32±0.56）ng/ml]明顯低于生理鹽水對照組[（69.4±13.67）ng/ml，（3.90±1.41）ng/ml]，也低于shRNA對照組[（66.8±3.50）ng/ml和（3.80±0.93）ng/ml，均P＜0.01]；在8w時，各組間膠原水平比較無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論SMAD3 shRNA在大鼠體內(nèi)能明顯減輕肝纖維化程度。

肝纖維化；SMAD3；shRNA；慢病毒；大鼠

1 材料與方法

1.1 慢病毒包裝和滴定我們先期工作中應(yīng)用PLL3. 7-shRNA慢病毒4質(zhì)粒系統(tǒng)已成功篩選和構(gòu)建了靶向大鼠SMAD3基因的shRNA重組慢病毒[15～17]。SMAD3 shRNA靶向的序列為5’-UGGUGCGAGAAGGCGGUCAdTdT-3’（根據(jù)GenBank提供的SMAD3基因序列NM_013095，靶向SMAD3堿基位點289～308）。shRNA對照序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’（上海吉瑪公司提供，該序列已被證實與大鼠和人基因組缺乏序列同源性）。將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒交給上海吉瑪公司，委托其進(jìn)行慢病毒大規(guī)模包裝和滴定。

1.2 動物模型制備 取雄性Wistar大鼠（中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供）66只，體重150～200g。抽簽法隨機(jī)將其分為肝纖維化模型組（60只）和正常對照組（6只）。再將模型組大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對照組（20只）、shRNA對照組（20只）和SMAD3 shRNA組（20只）。大鼠稱體質(zhì)量后，給予10%水合氯醛4mg.kg-1麻醉，碘酊消毒大鼠腹部脾區(qū)，用剪刀開一直徑1.5～2.0厘米的小口，用棉簽小心尋找并暴露脾臟，經(jīng)脾臟注射給藥。SMAD3 shRNA組、shRNA對照組慢病毒注射劑量均為1×108TU/只；生理鹽水對照組應(yīng)用等體積500μl生理鹽水。給藥1w后，選擇CCl4礦物油溶液，每周2次腹腔注射制備肝纖維化模型。第1次，給予模型組大鼠20%CCl4礦物油溶液1ml.kg-1bw注射，第2次給予30%CCl4礦物油溶液1ml.kg-1bw注射，第3次和第4次給予30%CCl4礦物油溶液2ml.kg-1bw注射，第5次給予40%CCl4礦物油溶液2ml.kg-1bw腹腔注射，以后以同樣劑量腹腔注射，每周2次。正常對照組為進(jìn)行肝組織病理學(xué)觀察而設(shè)，不注射慢病毒，但在同一時間點注射與模型組CCl4等量體積的礦物油。

1.3 標(biāo)本收集在造模4w后，處死模型組大鼠18只（各組6只）及3只正常對照組大鼠，經(jīng)下腔靜脈取血10ml～15ml，分離血清，放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)錂z。取出完整肝臟，取1cm×1cm×1cm大小組織，放入10%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，制備4μm切片，行HE、Masson和Reticulin染色，在光鏡下觀察；其余肝組織經(jīng)生理鹽水沖洗后剪成200 mg左右大小的組織塊，放入凍存管中，儲存于-80 ℃冰箱備用。慢病毒組剩余大鼠經(jīng)股靜脈給予加強(qiáng)注射慢病毒（1×108TU/只，方法同前）。繼續(xù)給予40%CCl4礦物油溶液腹腔注射造模，8w后將存活大鼠全部處死，收集標(biāo)本。

1.4 評估肝硬化造模成功的標(biāo)準(zhǔn)肝組織纖維增生程度評定標(biāo)準(zhǔn)參照Ruwary MF[18]等的文獻(xiàn)，將大鼠肝纖維化及肝硬化分為6級。

1.5 肝組織SMAD3 mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法，按照Trizol試劑說明提取肝組織總RNA，用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計目的基因引物。SMAD3引物序列為，上游：5’-GACGCAGGCTCTCCAAACCT-3’，下游：5’-TTGGACAGCAGGCCCAGACA-3’，擴(kuò)增位置為803～1029堿基位點。GAPDH引物序列為上游:5’-GCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游：5’-TCCACGATGCCAAAGTTGTCAT-3’，擴(kuò)增位置為411~650堿基位點。反應(yīng)體系20μl，設(shè)立2個復(fù)孔，按兩步法擴(kuò)增，預(yù)變性：95℃30s；PCR反應(yīng)：95℃5s，60℃30s，循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的基因SMAD3 mRNA的相對水平，計算公式如下：SMAD3 mRNA=2（CtGAPDH-CtSMAD3）。

1.6 血清I型膠原（Collagen I，COI I）和III型膠原（Collagen III，COI III）水平檢測采用ELISA法。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0 for Windows 統(tǒng)計軟件處理，計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析。對方差不齊資料，選用Kruskal-Wallis秩和檢驗。對方差分析或秩和檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果，進(jìn)一步選擇Bonferonni和LSD法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織SMAD3mRNA水平變化在造模4w時，SMAD3 shRNA組動物肝組織SMAD3mRNA水平顯著低于生理鹽水對照組和shRNA對照組（P=0.000；P=0.001，圖1A）；在造模8w時，SMAD3 shRNA組動物肝組織SMAD3mRNA水平同樣顯著低于生理鹽水對照組和shRNA對照組（P=0.001；P=0.009，圖1B）。

圖1 肝纖維化大鼠肝組織SMAD3mRNA水平比較

2.2 大鼠肝組織病理學(xué)變化在造模8w時，正常生理鹽水對照組和shRNA對照組肝組織有假小葉形成,肝纖維化達(dá)到Ⅳ～Ⅵ級，而SMAD3 shRNA組可見膠原纖維自匯管區(qū)或中央靜脈延伸明顯,包繞或未包繞整個肝小葉，肝纖維化分級為Ⅱ～Ⅲ級（圖2）。

圖2 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)

A、E、I：正常對照組；B、F、J：生理鹽水組；C、G、K：shRNA對照組；D、H、L：SMAD3 shRNA組（A、B、C、D為HE染色；E、F、G、H為Masson染色；I、J、K、L為網(wǎng)織染色，100×）

2.3 血清COI I和COI III水平的變化見表1。

表1 肝纖維化大鼠血清COI I和COI III水平（ng/ml，±s）比較

表1 肝纖維化大鼠血清COI I和COI III水平（ng/ml，±s）比較

與生理鹽水組和shRNA組比，①P＜0.05

生理鹽水shRNASMAD3 shRNA COI I 造模4w69.4±13.766.8±3.53.3±1.6①造模8w14.7±15.712.1±1.68.1±2.3 COI III 造模4w3.9±1.43.8±0.91.3±0.6①造模8w1.2±0.30.9±0.40.8±0.8

3 討論

TGF-β1作為最重要的細(xì)胞因子參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[20，21]。Sanderson N[23]et al將TGF-β1基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入裸鼠肝臟，發(fā)現(xiàn)裸鼠肝臟等主要器官發(fā)生纖維化，提示TGF-β1具有致組織纖維化作用。正常肝臟TGF-β1表達(dá)極少。當(dāng)肝臟受損時，肝臟Kupffer細(xì)胞和血小板釋放TGF-β1顯著增加，雖然不促進(jìn)HSC增殖，但是能通過TGF-β/ SMAD3途徑初始激活HSC，使HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞（Myofihroblast like cell，MFLC），分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），使單個細(xì)胞膠原合成增加60%～80%[22，23]。TGF-β1還能誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，抑制基質(zhì)MMP合成并促進(jìn)TIMP合成，同時抑制間質(zhì)膠原酶的活性，減少ECM降解。TGF-β1是肝纖維化形成的關(guān)鍵因子。因此，抑制或阻斷TGF-β1表達(dá)，將有可能抑制HSC的激活，減少ECM的形成和沉積，從而減輕肝臟纖維化程度或延緩肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。但是，TGF-β1是一個具有多生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，也是一種抗炎因子，過分地抑制會導(dǎo)致肝臟炎癥加重，從而不利于受損肝臟的逆轉(zhuǎn)。另外，在體和離體動物實驗表明，Activin A通過自分泌和旁分泌方式作用于HSC,促進(jìn)HSC增殖及分泌ECM,從而促進(jìn)了肝纖維化的形成及發(fā)展[24]。

研究表明，作為TGF-β和Activin的下游共同通路的SMAD3蛋白，在調(diào)節(jié)MFBs激活、誘導(dǎo)結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達(dá)、參與I型、III型膠原和ECM的合成分泌等肝纖維化發(fā)生的多個環(huán)節(jié)起著重要作用。因此，選擇特異性阻斷SMAD3 蛋白表達(dá)，一方面解除TGF-β和Activin對HSC的激活和促增殖作用，可以減輕ECM的形成和沉積，從而達(dá)到抑制肝纖維化的目的[25]；另一方面，也避免了直接阻斷TGF-β1而帶來的一系列副反應(yīng)。我們的實驗顯示，SMAD3 shRNA處理大鼠肝細(xì)胞炎癥壞死和纖維組織增生程度較生理鹽水對照組和shRNA對照組明顯減輕。

ECM包括膠原、糖蛋白及蛋白聚糖等成分[26]，COL-I和COL-III是肝纖維化和肝硬化時ECM的主要成分。我們檢測發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水對照組和shRNA對照組比，SMAD3 shRNA阻斷SMAD3表達(dá)后，血清COL-I 和COL-III分泌減少，說明在纖維化早期阻斷SMAD3能顯著降低COL-I 和COL-III分泌。

[1]Dooley S，Ten DP.TGF-β in progression of liver disease. Cell Tissue Res，2012，347（1）:245-256.

[2]鄭素軍，邢欣悅，韓源平，等.TGF-β1對大鼠HSC-T6細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和膠原分泌的影響.實用肝臟病雜志，2012，15（4）:327-331.

[3]Kreidl E，Oztürk D，Metzner T，et al.Activins and follistatins:Emergingrolesinliverphysiologyandcancer. World J Hepatol，2009，1（1）:17-27.

[4]Jones CP，Gregory LG，Causton B，et al.Activin A and TGF-β promote T（H）9 cell-mediated pulmonary allergic pathology.J Allergy Clin Immunol，2012，129（4）:1000-1003.

[5]Moffatt MF，Gut IG，Demenais F，et al.A large-scale，consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med，2010，363（13）:1211-1221.

[6]Lipardi C，Wei Q，Paterson B M.RNAi as random degradative PCR:siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs.Cell，2001，107（3）: 297-307.

[7]鄭素軍，林汝仙，夏云，等.KDR為靶的反義寡核苷酸、siRNA活性比較.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，30（3）:340-344，382.

[8]Caplen NJ，Parrish S，Imani F，et al.Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（17）:9742-9747.

[9]夏云，林汝仙，鄭素軍，等.靶向端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）RNAi載體的構(gòu)建及活性評價.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2004，31（12）:1079-1084.

[10]鄭素軍，夏云，任紅，等.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶小干擾RNA對肝癌細(xì)胞的體外抑制作用.中華肝臟病雜志，2004，12（9）:23-26.

[11]Zender L，Hutker S，Liedtke C，et al.Caspase 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（13）:7797-7802.

[12]Ying RS，Zhu C，F(xiàn)an XG，et al.Hepatitis B virus is inhibited by RNA interference in cell culture and in mice.Antiviral Res，2007，73（1）:24-30.

[13]George J，Tsutsumi M.siRNA-mediated knockdown of connectivetissuegrowthfactorpreventsN-nitrosodimethylamine-induced hepatic fibrosis in rats.Gene Ther，2007，14（10）:790-803.

[14]Nishitsuji H，Kohara M，Kannagi M，et al.Effective suppression of human immunodeficiency virus type 1 through a combination of short-or long-hairpin RNAs targeting essential sequences for retroviral integration.J Virol，2006，80（15）:7658-7666.

[15]陳鵬，鄭素軍，王世美，等.靶向大鼠Smad3基因的siRNA篩選及其shRNA重組慢病毒的構(gòu)建.臨床肝膽病雜志，2011，27（5）:533-537.

[16]鄭素軍，邢欣悅，武聚山，等.Smad3 shRNA抑制TGFβ1對HSC-T6細(xì)胞活化的抗肝纖維化作用.臨床肝膽病雜志，2012，28（4）:289-295.

[17]王世美，鄭素軍，邢欣悅，等.TGF-β1對大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A凋亡和細(xì)胞周期的影響.世界華人消化雜志，2011，19（16）：1659-1665.

[18]Ruwart MJ，Rush BD，Snyder KF，et al.16，16-Dimethyl prostaglandin E2 delays collagen formation in nutritional injury in rat liver.Hepatology，1988，8（1）:61-64.

[19]Bataller R，Brenner DA.Hepatic stellate cells as a target for the treatment of liver fibrosis.Semin Liver Dis，2001，21（3）:437-451.

[20]Gressner AM，Weiskirchen R，Breitkopf K，et al.Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis.Front Biosci，2002，7:d793-807. [21]MacLean JJ，Roughley PJ，Monsey RD，et al.In vivo intervertebral disc remodeling:kinetics of mRNA expression in response to a single loading event.J Orthop Res，2008，26（5）:579-588.

[22]Sanderson N，F(xiàn)actor V，Nagy P，et al.Hepatic expression of mature transforming growth factor beta 1 in transgenic mice results in multiple tissue lesions.Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92（7）:2572-2576.

[23]Chen YW，Li DG，Wu JX，et al.Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells stimulated by transforming growth factor-beta in vitro via up-regulation of Smad 7.J Ethnopharmacol，2005，100（3）:299-305.

[24]Kharbanda KK，Rogers DN，Wyatt TA，et al.Transforming growth factor-beta induces contraction of activated hepatic stellate cells.J Hepatol，2004，41（1）:60-66.

[25]Date M，Matsuzaki K，Matsushita M，et al.Differential regulation of activin A for hepatocyte growth and fibronectin synthesis in rat liver injury.J Hepatol，2000，32（2）:251-260.

[26]Miyazaki T，Karube M，Matsuzaki Y，et al.Taurine inhibits oxidative damage and prevents fibrosis in carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis.J Hepatol，2005，43（1）:117-125.

（收稿：2012-12-03）

（校對：陳從新）

The effect of lentivirus expressing shRNA targeted to rat SMAD3 on liver fibrosis in rats

Zhang Ying，Kong Heli，Zhang Jianjun，et al.302nd Hospital，Beijing 100039，China First Co-author:Kong Heli，Youan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100069，China

Zheng Sujun，E-mail:zhengsujun003@126.com

Objective To investigate the effects of lentivirus expressing shRNA targeted to rat SMAD3 on liver fibrosis in rats. Methods A total of 60 rats were randomly divided into three groups，i.e. SMAD3 shRNA group （n=20），shRNA control group （n=20）and normal saline group （n=20）. The lentivirus were intrasplenicly injected at the dose of 1.0×108TU per rat in experimental group，and in normal saline groups，the rats were given the same volume of normal saline. The liver fibrosis in rat were established by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride. The rats were sacrificed at week 4 and week 8 after CCL4injection，respectively. The SMAD3 mRNA levels in liver tissues was detected by using real-time PCR. The serum collagen I and collagen III were detected by ELISA. Results SMAD3 shRNA decreased the SMAD3 mRNA levels obviously at week 4 and 8 after CCL4injection（at week 4:P=0.000，P=0.001；at week 8:P=0.001，P=0.009），respectively，as compared with normal saline group and shRNA control group；the liver fibrosis in SMAD3 shRNA-treated rats improved at week 4 and 8；serum collagen I levels in SMAD3 shRNA-treated group decreased at week 4（3.33±1.60）ng/ml in SMAD3 shRNA，（69.4±13.67）ng/ml in normal saline and （66.8±3.50）ng/ml in shRNA control group（all P＜0.01）；serum collagen III in SMAD3 shRNA group decreased too at week 4，However，there were no significant differences among the 3 groups at week 8（P＞0.05）. Conclusions Blocking SMAD3 expression can significantly reduced the degree of liver fibrosis in rats.

Liver fibrosis；SMAD3；shRNA；Lentiviral vector；Rats；轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）和激活素（Activin）是主要的促肝纖維化細(xì)胞因子[1～3]，可激活肝星狀細(xì)胞（HSC），而SMAD3是TGF-β和激活素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中共同的關(guān)鍵信號蛋白[4，5]。特異性阻斷SMAD3 蛋白表達(dá)，有可能同時解除TGF-β和激活素的作用，起到高效抗肝纖維化作用。小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA）是基因功能研究和治療的高效工具[6～10]，目前已應(yīng)用于體內(nèi)進(jìn)行抗肝炎病毒、肝纖維化及肝衰竭的治療研究[11～13]。高效的siRNA導(dǎo)入手段是確保療效的另一關(guān)鍵步驟。以HIV-1為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體系統(tǒng)具有可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，及免疫反應(yīng)小等優(yōu)點，還可以通過將其攜帶的基因片段整合到宿主細(xì)胞基因組，實現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)，而且感染效率高，免疫原性低，是具有廣闊應(yīng)用前景的RNAi載體[14]。我們在前期研究中，以大鼠SMAD3為靶基因，成功篩選了siRNA作用靶點，并構(gòu)建了SMAD3 shRNA慢病毒表達(dá)系統(tǒng)[15]，在體外顯示了顯著的抗肝纖維化作用[16]。本研究采用四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型，探討了上述SMAD3 shRNA在體內(nèi)對肝纖維化的抑制作用。

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.03.012

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(No. 2013ZX10002002-006-001);國家自然科學(xué)基金( No. 30800979，81270532);北京市自然科學(xué)基金（No. 7102085）;北京市科技新星基金（No. 2007B055）; 四川省衛(wèi)生廳科研項目（No. 080137）；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才（No. 2011-3-083）

100039 北京市解放軍第302醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)中心（張瑩）；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院（孔賀利, 劉梅，任鋒，劉霜，陳煜，段鐘平，鄭素軍）；四川省廣元市第一人民醫(yī)院（張建軍）

張瑩，女，27歲，醫(yī)學(xué)碩士。主要從事重型肝炎/肝衰竭的防治研究。E-mail:zhang999ying@yahoo.com.cn

共同第一作者：孔賀利，女，35歲，大學(xué)本科，主管技師。主要從事肝病病理學(xué)研究。E-mail: kongheli@sina.com

鄭素軍，E-mail:zhengsujun003@126.com