俞海燕，吳文濤，王 薇，張 純

（北京大學(xué)第三醫(yī)院1.臨床干細(xì)胞研究中心、2.眼科中心，北京 100191）

目前，我國眼盲和低視力的發(fā)病率很高，引起的病因較多，且隨著年齡不同而不同。Dandona等［1］報道，導(dǎo)致低視力的疾病通常包括：視網(wǎng)膜疾?。ㄕ?5.2%）、弱視 （占 25.7%）、視神經(jīng)病變 （占14.3%）、青光眼（占11.4%）、角膜疾?。ㄕ?.6%）等等，可以看到，除了角膜疾病外，其他疾病均由于視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生病變引起。由于神經(jīng)細(xì)胞損傷后不能再生，因此，目前大多數(shù)致盲疾病沒有可靠的治療方法。隨著干細(xì)胞研究的發(fā)展，干細(xì)胞可能為那些視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞病變導(dǎo)致疾病的治療提供一個新的突破口［2-6］。本實驗擬用優(yōu)化的方法從人骨髓中分離間充質(zhì)干細(xì)胞、進(jìn)行體外培養(yǎng)，并誘導(dǎo)其向視網(wǎng)膜終末細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 材料 正常成人骨髓，無先天性視網(wǎng)膜遺傳疾病。均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將抽取的骨髓用PBS沖洗，1 000 r·min-1×10 min共2～3次，用 Ficoll密度梯度離心法分離獲得單細(xì)胞。2%臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞，以3×105個／cm2的密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，24～48 h后換液。以后每3～4天換液一次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化以1∶2比例進(jìn)行傳代。該細(xì)胞在體外至少可傳代15～16代，用第5代以上的細(xì)胞做細(xì)胞表型分析及體外誘導(dǎo)分化研究。

1.3 細(xì)胞表型分析 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后，用PBS洗2次，以每管4×105個細(xì)胞分裝到流式管。使用標(biāo)記有鼠單克隆藻紅蛋白（PE）的 CD44、CD90、CD38抗體和 FITC標(biāo)記的CD34、CD14、CD45、CD147、HLA-DR （Becton Dicksinson）抗體，使用鼠 IgG1k-PE、IgG1k-FITC、IgG2ak-PE、IgG2bk-PE（Becton Dicksinson）、IgG2ak-FITC（Chemicon）等抗體作為對照。4℃孵育30 min后，洗滌，固定。用流式細(xì)胞儀（Becton Dicksinson）的CellQuest軟件采集數(shù)據(jù)并分析細(xì)胞表面不同抗原的相對含量。

1.4 骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化 將體外擴(kuò)增的人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，其內(nèi)放有經(jīng)賴氨酸處理的蓋玻片，誘導(dǎo)孔內(nèi)培養(yǎng)液為含1%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液，分為兩組，分別加或不加EGF，每2～3天換液一次，對照使用人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。均在37℃、5%CO2飽和濕度的CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d。

1.5 免疫熒光染色鑒定 使用誘導(dǎo)液培養(yǎng)的細(xì)胞爬片進(jìn)行染色鑒定。具體步驟：將細(xì)胞爬片用PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min；4%多聚甲醛室溫固定15～20 min；PBS洗滌3次，每次3～5 min；10%BSA 37℃封閉 30 min；加入一抗，37℃孵育 30 min；0.1%Tween20-PBS洗滌3次，每次3～5 min；加入 FITC和TRITC分別標(biāo)記的二抗，室溫孵育60 min；0.1%Tween 20-PBS洗滌3次，每次3～5 min；抗熒光衰減封片劑封片；熒光顯微鏡下觀察并照相。

染色一抗分別用小鼠抗人Nestin單克隆抗體（美國BD公司）、小鼠抗人Rhodopsin單克隆抗體和小鼠抗人 CD90單克隆抗體（美國 Santa-Cruz公司）、兔抗人GFAP多克隆抗體（Chemicon公司），二抗分別用TRITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體和FITC標(biāo)記的羊抗兔抗體（北京中山試劑公司）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 接種后細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，形態(tài)不一，種類較多。1 d后有少量成纖維樣細(xì)胞貼壁，此后貼壁細(xì)胞漸漸增多，折光性強(qiáng)，約1周左右這些成纖維樣細(xì)胞匯聚到80%～90%，呈柵欄狀或漩渦狀排列（Fig 1A）。細(xì)胞經(jīng)傳代逐漸純化，在體外至少可傳15～16代，且增殖能力、細(xì)胞形態(tài)、大小與顆粒度保持不變。

Fig 1 Morphologic change of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by inverted phase contrast microscope（×100）A：Before induction，the cultured bone marrow-derived mesenchymal stem cells were fibroblast-like cells；B：After induction，the morphology of cultured cells were neuron-like cells.

2.2 細(xì)胞表面標(biāo)志檢測 培養(yǎng)細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)與間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)基本一致。它們均不表達(dá)造血系統(tǒng)的標(biāo)志CD34、CD38、CD45、CD14和HLA-DR，而表達(dá)多種黏附分子 CD44、CD90和CD147（Fig 2）。

2.3 體外誘導(dǎo)分化

2.3.1 光鏡下觀察 骨髓來源的細(xì)胞在誘導(dǎo)液（含1%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液，加或不加EGF）中培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞胞體向細(xì)胞核收縮，漸漸地大多數(shù)細(xì)胞均轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃粕窠?jīng)元的形態(tài)，形成不規(guī)則的梭形，部分細(xì)胞有多個突起，終末端有類似神經(jīng)元細(xì)胞突觸的結(jié)構(gòu)；有的突起逐漸伸長，形成圓錐狀終末端，而對照組細(xì)胞形態(tài)無改變（Fig 1B）。

2.3.2 免疫熒光染色結(jié)果 在1%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液不加EGF組中（含1%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液），誘導(dǎo)2周后可以得到神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物 nestin（Fig 3A）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP表達(dá)陽性的細(xì)胞（Fig 3B）；在1%胎牛血清的αMEM培養(yǎng)液加EGF組中（添加EGF的濃度是20 mg·L-1，需要在CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)誘導(dǎo)14 d），不僅可以得到以上兩種細(xì)胞，還可以誘導(dǎo)得到光感受器細(xì)胞Rhodopsin表達(dá)陽性的細(xì)胞（Fig 3C），同時，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物CD90轉(zhuǎn)為陰性。而對照組均無陽性細(xì)胞出現(xiàn)。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是起源于中胚層的一種多能干細(xì)胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，其分布廣泛，主要存在于骨髓，也可以見于肌肉、脂肪、胎盤、臍帶、骨、軟骨及韌帶等。在體外培養(yǎng)條件下，該細(xì)胞能夠通過自我復(fù)制產(chǎn)生大量同類細(xì)胞，同時具有多向分化的潛能，有研究顯示其可跨越胚層限制而分化為外胚層來源的神經(jīng)元細(xì)胞［7-9］。目前國內(nèi)外均有報道，體外培養(yǎng)［7，10-11］或體內(nèi)移植［12-14］的 MSCs可定向分化為表達(dá)神經(jīng)元表面標(biāo)志的細(xì)胞。

MSCs表面標(biāo)志的特征呈非單一性，同時表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等不同細(xì)胞類型的表面標(biāo)志。其中 CD29、CD44、CD90、CD147、CD166是目前被公認(rèn)的MSC的重要表面標(biāo)記［2-3］。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面抗原研究結(jié)果顯示：MSCs不表達(dá)造血前體細(xì)胞的表面抗原，如CD34、CD38；不表達(dá)白細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原CD45；不表達(dá)抗原呈遞細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原HLA-DR和單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD14。但是，MSCs表達(dá)整合素家族成員CD29以及黏附分子CD44、CD166、CD90。在本研究中，我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀對體外培養(yǎng)的骨髓來源的間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，CD44、CD147、CD90表達(dá)陽性，而 CD34、CD45、CD38、HLA-DR、CD14表達(dá)陰性，證明本研究獲得的MSCs表面標(biāo)志抗原與文獻(xiàn)報道基本一致，可以肯定我們從成人骨髓中獲得的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。

Tomita等［15］將PKH-67標(biāo)記的富含干細(xì)胞的骨髓來源細(xì)胞注射到經(jīng)機(jī)械損傷視網(wǎng)膜動物的玻璃體腔內(nèi)，2周后該細(xì)胞整合到視網(wǎng)膜損傷區(qū)域，并表達(dá)成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原。之后，Minamino等［6］延長觀察時間到1年，仍能檢測到BMSC來源的神經(jīng)細(xì)胞。本研究利用從骨髓分離得到的MSCs，經(jīng)體外誘導(dǎo)后，分化細(xì)胞不再表達(dá)MSCs的表面標(biāo)志抗原，而表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞及光感受器細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原，說明這些MSCs具有分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的能力。如果使用此方法將hMSCs在體外誘導(dǎo)成為分化細(xì)胞，再移植到機(jī)械損傷視網(wǎng)膜動物的玻璃體腔或視網(wǎng)膜下腔，由于其已經(jīng)具有神經(jīng)細(xì)胞及光感受器細(xì)胞的表面標(biāo)志物，相比以上文獻(xiàn)報道的細(xì)胞而言，它們不僅可以整合到損傷視網(wǎng)膜區(qū)域，而且更容易分化為成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞，有助于修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜。我們希望下一步的工作是通過動物實驗來證實其具有視網(wǎng)膜細(xì)胞的功能。

Fig 3 Expression of nestin（A），GFAP（B）and Rhodopsin（C）in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells after induction（×200）The results indicated that the induced cells could differentiate，expressing the surface markers of neuron，even the surface markers of retinal photoreceptor cells

近年來，干細(xì)胞研究已經(jīng)為神經(jīng)元損傷性疾病開拓了新的思路，細(xì)胞移植替代治療正在成為有效治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性病變的新途徑。有關(guān)干細(xì)胞在視網(wǎng)膜應(yīng)用方面的實驗研究發(fā)展很快，從已有的很多研究中可以知道，胚胎干細(xì)胞［16］和神經(jīng)干細(xì)胞［17］在眼內(nèi)移植后可以整合到宿主視網(wǎng)膜并分化為形態(tài)類似視網(wǎng)膜細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞。Tropepe等［18］發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠眼內(nèi)存在視網(wǎng)膜干細(xì)胞，國內(nèi)也有人胚胎來源視網(wǎng)膜干細(xì)胞的報道［19］，由于其與視網(wǎng)膜具有組織同源性，較以上兩種細(xì)胞有著更大的優(yōu)越性。2013年，Xia等［20］研究表明，骨髓MSCs可以提高視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的增殖能力，經(jīng)MSCs來源的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)，視網(wǎng)膜前體細(xì)胞可以分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，包括Brn3a陽性的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC）和視紫紅質(zhì)陽性的光感受器細(xì)胞，而向視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化則明顯減少。這說明骨髓MSCs表達(dá)各種細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)組織來源細(xì)胞具有強(qiáng)大的營養(yǎng)和保護(hù)功能。如果將此細(xì)胞與本研究中獲得的體外分化后的細(xì)胞共同移植到眼內(nèi)，相信可以促進(jìn)細(xì)胞在體內(nèi)的成熟和分化。即使如此，無論是胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞還是視網(wǎng)膜干細(xì)胞，都面臨著標(biāo)本獲得困難和社會倫理道德的問題，極大程度地限制了其在臨床的應(yīng)用。而由于MSCs可以從患者骨髓中直接抽取或者通過骨髓動員從外周血中分離獲得，從而規(guī)避了細(xì)胞來源面臨的困難，也避免了人胚胎干細(xì)胞伴隨的倫理問題；而且骨髓來源的MSCs在體外易于純化、培養(yǎng)，能夠通過自我復(fù)制大量擴(kuò)增，保證了足夠數(shù)量的移植細(xì)胞；另外，由于骨髓來源的MSCs屬于自體移植，避免了宿主細(xì)胞和移植細(xì)胞之間的免疫排斥反應(yīng)以及移植術(shù)后免疫抑制劑的大量使用，再加上骨髓MSCs具有向神經(jīng)細(xì)胞［21-22］分化的特性，從而在對神經(jīng)細(xì)胞損傷性疾病采取細(xì)胞移植治療的策略中，骨髓來源的MSCs成為理想的種子細(xì)胞。

本實驗從成人骨髓中分離、培養(yǎng)得到的MSCs，在體外誘導(dǎo)后可表達(dá)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的表面標(biāo)志抗原，從而證實該細(xì)胞具有向視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能，為其移植治療視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷性疾病提供了實驗依據(jù)。

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