王岱君，田 華

（濰坊醫(yī)學(xué)院1.山東省重點(diǎn)學(xué)科人體解剖與組織胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室，2.校醫(yī)院，山東 濰坊 261053）

肢體缺血／再灌注損傷常見(jiàn)于骨外科、創(chuàng)傷外科、血管外科等，其后果是通過(guò)一系列病理生理反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷乃至壞死。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)缺血／再灌注損傷進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間大量的研究，但這些研究主要集中于心、腦、腎、肝等組織器官［1－5］。脈絡(luò)寧注射液是一種中藥制劑，廣泛應(yīng)用于心腦血管病的治療。我們前期工作發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)寧注射液具有保護(hù)肢體缺血／再灌注損傷的作用［6－7］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，采用原位分子雜交方法檢測(cè)骨骼肌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶mRNA（iNOS mRNA）及內(nèi)皮型一氧化氮合酶mRNA（eNOS mRNA）表達(dá)，進(jìn)一步探討脈絡(luò)寧注射液對(duì)缺血／再灌注骨骼肌的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為清潔級(jí)健康成年♂新西蘭大耳白兔，共30只，體質(zhì)量（2.0～2.5）kg，平均 2.2 kg，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為室溫25℃，濕度40%～60%。普通飼料喂養(yǎng)，正常飲水。

1.2 主要試劑與儀器 脈絡(luò)寧注射液由金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：20111030，10 ml／支；iNOS mRNA、eNOSmRNA原位分子雜交試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；TDZ5-WS離心機(jī)由長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)；MetaMorph／DP10／BX41顯微圖像分析系統(tǒng)由 UIC／OLYMPUS，US／JP生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立 30只動(dòng)物隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（Sham），缺血／再灌注組（I／R）和脈絡(luò)寧組（Mailuoning），每組10只，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食。參照 Nanobashvili等［8］的方法建立兔后肢缺血／再灌注動(dòng)物模型。30只動(dòng)物皆自耳緣靜脈注射體積分?jǐn)?shù)為0.20的烏拉坦5 ml·kg－1進(jìn)行麻醉，右腹股溝區(qū)小心剪毛，勿傷及皮膚，消毒，鋪蓋無(wú)菌洞巾，沿股血管神經(jīng)走行方向切開(kāi)皮膚，在解剖顯微鏡下分離暴露股動(dòng)、靜脈及股神經(jīng)。缺血／再灌注組與脈絡(luò)寧組動(dòng)物用微血管夾夾閉股動(dòng)脈，在后肢近側(cè)端用橡皮止血帶進(jìn)行環(huán)扎阻斷側(cè)枝循環(huán)，以保證右后肢血液完全斷流。2 h后除去血管夾及橡皮止血帶，恢復(fù)血供。假手術(shù)組動(dòng)物只切開(kāi)腹股溝處皮膚暴露股血管，不進(jìn)行夾閉股動(dòng)脈及環(huán)扎后肢。

在缺血后2 h，即肢體即將恢復(fù)血供時(shí)，脈絡(luò)寧組各動(dòng)物靜脈注射脈絡(luò)寧注射液1.5 ml·kg－1，其他兩組每只動(dòng)物分別注射等體積的生理鹽水。

1.4 取材及樣品制備 再灌注后4、8、12和24 h，各組分別自術(shù)側(cè)脛骨前肌切取約2 cm×1 cm×0.5 cm大小的骨骼肌組織，置于含有1／1 000 DEPC的0.4%多聚甲醛溶液中固定，用于iNOSmRNA、eNOSmRNA表達(dá)的檢測(cè)。

1．5 骨骼肌iNOSmRNA及eNOSmRNA檢測(cè) 將固定的骨骼肌標(biāo)本常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片。同一張載玻片上貼2張切片，分別用于檢測(cè)iNOSmRNA和eNOSmRNA。原位雜交具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，棕黃色為陽(yáng)性雜交信號(hào)。顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性染色進(jìn)行分析，雜交信號(hào)的強(qiáng)弱以平均光密度表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，應(yīng)用SPSS 16.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組樣本均數(shù)比較行單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較用Newman-Keuls檢驗(yàn)（q檢驗(yàn)）。

2 結(jié)果

2．1 骨骼肌iNOS mRNA表達(dá) 假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)iNOSmRNA皆有少量表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)差異（P＞0.05）。缺血／再灌注組iNOSmRNA表達(dá)自再灌注后2 h開(kāi)始逐漸增高，至8 h達(dá)高峰，之后逐漸下降，再灌注后8 h與其他時(shí)間點(diǎn)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較均明顯增高（P＜0.01或P＜0.05）。脈絡(luò)寧組iNOSmRNA表達(dá)與缺血／再灌注組同時(shí)間點(diǎn)比較明顯降低（P＜0.01或P＜0.05），與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，除再灌注后8 h外，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Comparison of iNOS mRNA expression among groups（ˉx±s，n＝10）

2．2 骨骼肌eNOS mRNA表達(dá) 假手術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)皆有eNOSmRNA表達(dá)。缺血／再灌注組在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），脈絡(luò)寧組再灌注后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)與缺血／再灌注組同時(shí)間點(diǎn)比較明顯增高（P＜0.01或P＜0.05）。見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Comparison of eNOS mRNA expression among groups（ˉx±s，n＝10）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肢體缺血／再灌注后骨骼肌組織內(nèi)iNOSmRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。肢體缺血／再灌注后可產(chǎn)生釋放大量活性氧物質(zhì)和炎癥介質(zhì)，組織內(nèi)過(guò)氧化反應(yīng)明顯增強(qiáng)，從而誘生并活化骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的iNOS，而使組織中NO生成增多，介導(dǎo)缺血／再灌注損傷。研究結(jié)果顯示，iNOSmRNA在再灌注后2 h表達(dá)明顯升高，在再灌注后8 h達(dá)高峰，表明肢體缺血／再灌注后的2 h～8 h內(nèi)有大量刺激因子產(chǎn)生。再灌注8 h后，iNOSmRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是缺血／再灌注產(chǎn)生釋放的刺激因子在再灌注8 h后逐漸減少，或是隨病程的發(fā)展，組織細(xì)胞因損傷而致基因轉(zhuǎn)錄下降，也可能是誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量NO對(duì)iNOS基因表達(dá)具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。應(yīng)用脈絡(luò)寧后iNOS mRNA明顯降低，表明脈絡(luò)寧能夠抑制缺血／再灌注后iNOSmRNA表達(dá)的上調(diào)，從而抑制由其誘生的高水平NO而介導(dǎo)組織損傷。

關(guān)于缺血／再灌注后eNOSmRNA以及蛋白的表達(dá)是增強(qiáng)還是降低，觀點(diǎn)不一。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，缺血／再灌注后內(nèi)皮損傷導(dǎo)致內(nèi)皮機(jī)能障礙，eNOS mRNA表達(dá)降低。但也有學(xué)者認(rèn)為，缺血／再灌注后eNOS mRNA及蛋白的表達(dá)并無(wú)明顯降低［9］，甚至可使表達(dá)增強(qiáng)［4］。我們的研究顯示，缺血／再灌注組在各時(shí)間點(diǎn)eNOS mRNA表達(dá)與假手術(shù)組比較均無(wú)明顯變化，這與第二種觀點(diǎn)基本一致。應(yīng)用脈絡(luò)寧后eNOSmRNA的表達(dá)明顯增高，可能是在缺血／再灌注過(guò)程中脈絡(luò)寧能夠上調(diào)eNOS mRNA表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮功能、減少黏附分子表達(dá)和阻止中性粒細(xì)胞遷移等作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)是從基因水平對(duì)肢體缺血／再灌注后iNOSmRNA及eNOSmRNA的表達(dá)及脈絡(luò)寧對(duì)其表達(dá)的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明缺血／再灌注過(guò)程中iNOSmRNA表達(dá)增強(qiáng)，脈絡(luò)寧可下調(diào)再灌注過(guò)程中iNOSmRNA表達(dá)，上調(diào)eNOSmRNA表達(dá)，對(duì)肢體缺血／再灌注損傷具有保護(hù)作用。但本實(shí)驗(yàn)只是從mRNA的表達(dá)進(jìn)行了研究，未能結(jié)合iNOS、eNOS的蛋白表達(dá)進(jìn)行對(duì)比研究是其不足，今后尚需進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：

［1］王 蕾，張 曦，朱學(xué)慧，等.無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)不同病程糖尿病大鼠缺血／再灌注心肌的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（4）：495－500.

［1］Wang L，Zhang X，Zhu X H，et al.Cardioprotection of noninvasive limb ischemic preconditioning against ischemia-reperfusion injury in myocardium with different duration of diabetes mellitus in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（4）：495－500.

［2］Diaz M N，F(xiàn)rei B，Vita JA，Keaney JF.Antioxidants and atherosclerotic heart disease［J］.N Engl J Med，1997，337（6）：408－16.

［3］陶 莉，望運(yùn)玲，武雙嬋，等.丁香酚對(duì)大鼠局灶性腦缺血／再灌注神經(jīng)保護(hù)作用的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（8）：1146－50.

［3］Tao L，Wang Y L，Wu SC，et al.Neuroprotective effects of eugenol on cerebralischemia／reperfusion injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（8）：1146－50.

［4］Kü?ük A，Yucel M，Erkasap N，et al.The effects of PDE5 inhibitory drugs on renal ischemia／reperfusion injury in rats［J］.Mol Biol Rep，2012，39（10）：9775－82.

［5］王陽(yáng)陽(yáng)，馬幼敏，田 媛，等.sEH抑制劑對(duì)大鼠肝缺血／再灌注損傷的影響及其機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（4）：590－1.

［5］Wang Y Y，Ma Y M，Tian Y，et al.Effect of sEH inhibitor on hepatic I／R injury in rats and its mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（4）：590－1.

［6］王岱君，王金平，鞠學(xué)紅，等.脈絡(luò)寧對(duì)兔肢體缺血／再灌注損傷的防護(hù)作用［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2004，20（4）：234－7.

［6］Wang D J，Wang JP，Ju X H，et al.Protective effect of Mailuoning on ischemia／reperfusion injury in extremities of rabbits［J］.Chin J Trauma，2004，20（4）：234－7.

［7］梁倩倩，田 華，莊寶祥，等.脈絡(luò)寧對(duì)兔肢體缺血／再灌注損傷過(guò)程中SOD及MPO的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（6）：885－6.

［7］Liang Q Q，Tian H，Zhuang B X，et al.Effect of Mailuoning on SOD and MPOduring process in rabbit extremity ischemia／reperfusion injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（6）：885－6.

［8］Nanobashvili J，Neumayer C，F(xiàn)ügl A，et al.Ischemia／reperfusion injury of skeletal muscle：plasma taurine as a measure of tissue damage［J］.Surgery，2003，133（1）：91－100.

［9］Wan L L，Xia J，Ye D，et al.Effects of quercetin on gene and protein expression of NOX and NOSafter myocardial ischemia and reperfusion in rabbit［J］.Cardiovasc Ther，2009，27（1）：28－33.