何丹,楊林,張景勍

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,重慶 400016;2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院,重慶 401331)

超高效液相色譜法測定藿香正氣口服液中香豆素類成分的含量

何丹1,楊林2,張景勍1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,重慶 400016;2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院,重慶 401331)

目的 建立以超高效液相色譜法(UPLC)測定藿香正氣口服液中歐前胡素和異歐前胡素含量的方法。方法色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),流動相為水-甲醇不同比例梯度洗脫,柱溫30℃,流速0.3 mL·min-1,檢測波長為248 nm。結(jié)果歐前胡素在1.305～13.050 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程:Y=13 633X+3 976(r=0.999 9),平均回收率為99.25%,RSD=0.74%;異歐前胡素在0.596～5.960 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程:Y=10 661X+1 073(r=0.999 9),平均回收率為98.94%,RSD=0.63%。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、快速、可靠,能有效地測定藿香正氣口服液中歐前胡素和異歐前胡素的含量。

藿香正氣口服液;歐前胡素;異歐前胡素;色譜法,超高效液相

藿香正氣口服液是由蒼術(shù)、陳皮、厚樸、白芷等10味中藥制成的復(fù)方口服制劑,具有解表化濕、理氣和中之功效。用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯,夏傷暑濕,頭痛昏重,脘腹脹痛,嘔吐泄瀉,胃腸型感冒[1]。2010年版《中華人民共和國藥典》中藿香正氣口服液中含量測定項規(guī)定對厚樸酚與和厚樸酚和橙皮苷進行含量測定,作為質(zhì)量控制指標(biāo)[1]。目前對“藿香正氣”類制劑含量測定方法多見于采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法對厚樸酚、和厚樸酚、陳皮苷及百秋李醇進行測定[2-5]。筆者未見對處方中白芷藥材中的香豆素類成分的含量進行測定的報道。由于香豆素類成分是白芷藥材中含量較高的活性成分之一,主要含歐前胡素和異歐前胡素,藥理活性明確,故是判別白芷藥材質(zhì)量優(yōu)劣的重要依據(jù)[6]。目前關(guān)于中藥材及中成藥中歐前胡素和異歐前胡素測定方法的文獻報道主要有薄層掃描法和HPLC法[6-8],筆者未見采用超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)法進行測定。筆者采用UPLC法對藿香正氣口服液中的歐前胡素和異歐前胡素進行含量測定的報道。該方法高效、快速,重復(fù)性和精密度良好,適用于藿香正氣口服液中歐前胡素和異歐前胡素的測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC(美國Waters公司);ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)色譜柱(美國Waters公司)。

1.2 試藥 藿香正氣口服液(太極集團重慶涪陵制藥廠,批號:11071571,11122024,12061274);歐前胡素對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110826-201013);異歐前胡素對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110827-200407);甲醇為色譜純(山東禹王實業(yè)總公司化工廠),實驗用水為超純水,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);柱溫:30℃;為避免樣品的相互干擾以及保護色譜柱,采用水-甲醇為流動相,按表1所示梯度洗脫;檢測波長248 nm;流速0.3 mL·min-1;進樣量1 μL,理論板數(shù)按歐前胡素和異歐前胡素峰計算不低于3 000。

表1 水-甲醇梯度洗脫表Tab.1 Procedure of gradient elution of water-methanol

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品儲備液的制備 精密稱取歐前胡素對照品0.01 305 g,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得歐前胡素對照品儲備液。精密稱取異歐前胡素對照品0.00 596 g,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得異歐前胡素對照品儲備液。分別精密吸取上述對照品儲備液各5 mL,置50 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得歐前胡素濃度為13.05 μg·mL-1、異歐前胡素濃度為5.96 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取藿香正氣口服液1 mL置于10 mL量瓶中,加水稀釋并定容至刻度,搖勻,用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 分別精密量取混合對照品溶液和供試品溶液,按“2.1”項色譜條件進樣測定,結(jié)果歐前胡素和異歐前胡素峰與其他峰分離良好,無干擾。見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液1.00, 2.00,4.00,6.00,8.00,10.00 mL,置10 mL量瓶中,加水定容,搖勻,即得系列混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件測定,以峰面積(Y)對濃度(X,μg·mL-1)進行線性回歸。歐前胡素的回歸方程為:Y=13 633X+ 3 976(r=0.999 9);異歐前胡素的回歸方程為:Y= 10 661X+1 073(r=0.999 9)。結(jié)果表明,歐前胡素濃度在1.305～13.050 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;異歐前胡素濃度在0.596～5.960 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

A.混合對照品溶液;B.藿香正氣口服液;1.歐前胡素;2.異歐前胡素圖1 藿香正氣口服液和對照品溶液UPLC色譜圖A.mix standards solution;B.huoχiang zhengqi oral liquid;1. imperatorin;2.isoimperatorinFig.1 UPLC chromatogram of huoxiang zhengqi oral liquid and mix standards solution

2.5 精密度實驗 取批號為11071571藿香正氣口服液,按供試品配制方法配制樣品溶液,按“2.1”項下方法連續(xù)進樣6次,測定峰面積。結(jié)果歐前胡素和異歐前胡素的RSD分別為0.31%和0.42%。符合精密度實驗要求。

2.6 穩(wěn)定性實驗 取批號為11071571藿香正氣口服液,按供試品溶液配制方法配制樣品溶液,室溫下放置0,1,2,4,6,8 h,按“2.1”項下色譜條件分別進樣1 μL測定峰面積。結(jié)果峰面積基本不變,歐前胡素和異歐前胡素的RSD分別為0.36%和0.48%,表明溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗 取批號為11071571藿香正氣口服液,按供試品配制方法平行配制6份,按“2.1”項下方法進樣分析,按外標(biāo)法以峰面積計算含量,歐前胡素和異歐前胡素的平均含量分別為12.00 μg·mL-1和5.16 μg·mL-1,RSD分別為0.36%和0.43%。

2.8 加樣回收實驗 精密稱取18份已知含量的同一批號藿香正氣口服液0.5 mL(歐前胡素含量12.00 μg·mL-1,異歐前胡素含量5.16 μg·mL-1)于10 mL量瓶中,分別精密加入相當(dāng)于制劑中歐前胡素和異歐前胡素含量的80%,100%和120%的歐前胡素和異歐前胡素對照品,按供試品溶液制備下方法制備溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣1 μL,按外標(biāo)法計算回收率。結(jié)果歐前胡素平均回收率99.25%,RSD= 0.74%(n=9),異歐前胡素的平均回收率98.94%, RSD=0.63%(n=9)。見表2。

2.9 含量測定 3批樣品按供試品溶液配制方法配制,按“2.1”項下色譜條件進樣分析,按外標(biāo)法以峰面積計算含量,歐前胡素和異歐前胡素的測定結(jié)果見表3。

表3 藿香正氣口服液中歐前胡素和異歐前胡素含量測定Tab.3 Contentdeterminationofimperatorinand isoimperatorin in huoxiang zhengqi oral liquid n=3

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 通過測定歐前胡素的紫外吸收光譜可知:歐前胡素在260 nm以下有強吸收, 302 nm波長處有較大吸收,《中華人民共和國藥典》及文獻中選用302 nm作為檢測波長的較多,但也有選擇248 nm作為測定波長[9-10],本實驗曾選用雙通道進行測定篩選,發(fā)現(xiàn)在248 nm比在302 nm吸收更強,且流動相在此波長處對吸收峰也無干擾,故選擇248 nm進行測定。

3.2 流動相的選擇 關(guān)于HPLC法測定歐前胡素和異歐前胡素含量的文獻報道中有多種流動相[7,11]。筆者在本實驗曾比較乙腈-水和甲醇-水分離系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-水(55∶45)可達(dá)到良好的分離效果,歐前胡素在4.1 min出峰,異歐前胡素在6.7 min出峰,峰形對稱,分離效果和柱效都比HPLC法更為好,且分析速度快。但考慮到中成藥的多組分,避免樣品間的相互干擾,同時要保護色譜柱,本實驗在兩組分出峰后采取了梯度洗脫,以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:1231.

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DOI 10.3870/yydb.2014.10.031

Determination of Coumarin in Huoxiang Zhengqi Oral Liquid by UPLC

HE Dan1,YANG Lin2,ZHANG Jing-qing1
(1.College of Pharmacy,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.School of Pharmacy,Chongqing Medical and Pharmaceutical College,Chongqing 401331, China)

ObjectiveTo establish a UPLC method for detecting content of imperatorin and isoimperatorin inhuoχiang zhengqioral liquid.MethodsACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)was used and the mobile phase was methanol and water by gradient elution mode.The column temperature was 30℃,the flow rate was 0.3 mL·min-1and the detection wavelength was 248 nm.ResultsThe linear range of imperatorin was 1.305-13.050 μg·mL-1and the regression equation was as follows:Y=13 633X+3 976(r=0.999 9).The linear range of isoimperatorin was 0.596-5.960 μg·mL-1and the regression equation wasY=10 661X+1 073(r=0.999 9).The average recovery was 99.25%(RSD=0.74%)and 98.94% (RSD=0.63%),respectively.ConclusionThe method is accurate,rapid and reliable,and can be used to determine imperatorin and isoimperatorin inhuoχiang zhengqioral liquid.

Huoχiang zhengqioral liquid;Imperatorin;Isoimperatorin;Chromatography,ultra performance liquid

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)10-1370-03

2013-09-13

2013-11-20

何丹(1977-),女,四川達(dá)州人,講師,在讀博士,主要從事藥物分析研究。電話:(0)15310985850,E-mail:ildoctor@163.com。

張景勍(1974-),女,重慶人,研究員,博士,主要從事藥物制劑研究。電話:(0)13308300303,E-mail:zjqrae01 @163.com。