丁安明，陳雅瓊，Zahid Hussain，康 樂，張?zhí)N睿，崔萌萌，王 倩，孫玉合*

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煙草GA代謝相關(guān)基因和的克隆和表達(dá)分析

丁安明1,2，陳雅瓊1,2，Zahid Hussain1,2，康 樂1,2，張?zhí)N睿1,2，崔萌萌1，王 倩1，孫玉合1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

為了解赤霉素（gibberellic acids, GA）在煙草生長發(fā)育中的作用，本研究利用同源克隆和RACE技術(shù)分離了3個(gè)煙草種GA代謝相關(guān)基因和的6條序列，對(duì)其進(jìn)行了序列比對(duì)和進(jìn)化分析；并利用熒光定量表達(dá)分析研究了其在林煙草和普通煙草中的表達(dá)譜。結(jié)果表明，相關(guān)基因在煙草屬和茄科作物中保守性很高；普通煙草中克隆的和可能起源于絨毛狀煙草。表達(dá)分析表明，和在林煙草生長發(fā)育早期和莖伸長期分別在葉和莖中的表達(dá)量顯著高于其他組織。

煙草；赤霉素；熒光定量表達(dá)分析

赤霉素（gibberellic acids, GA）是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的一類重要的二萜類激素，作用于植物整個(gè)生命周期，包括種子萌發(fā)、莖的伸長、開花誘導(dǎo)、花藥發(fā)育及種子和果實(shí)的生長等[1-2]。目前，植物中GA的代謝途徑已經(jīng)基本確定，由C20前體牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphoaphate, GGDP）經(jīng)一系列酶催化生成[3]。該代謝途徑的第一步和第二步催化反應(yīng)在植物葉綠體內(nèi)完成，由古巴焦磷酸合酶（ent-copalyl pyrophosphate synthase, CPS）和內(nèi)根-貝殼杉烯合酶（ent-kaurene synthase, KS）催化GGDP形成內(nèi)根-貝殼杉烯。編碼CPS和KS兩種酶的基因分別為和，并已在擬南芥、水稻、豌豆等植物中進(jìn)行了克隆和功能驗(yàn)證分析[4-8]。Sun等[5]從擬南芥野生型分離了全長cDNA，證實(shí)該基因的產(chǎn)物為CPS，并用35S標(biāo)記將該酶定位于葉綠體。Yamaguchi等[6]利用擬南芥矮化突變體及已克隆的南瓜cDNA做同源探針，克隆了該基因并通過放射性標(biāo)記酶底物證實(shí)了其功能。Fleet等[8]對(duì)擬南芥和分別和同時(shí)進(jìn)行過表達(dá)分析，并檢測了基因直接產(chǎn)物CPS、KS及植株中的GA含量，發(fā)現(xiàn)雖然CPS和KS的含量大大升高，但擬南芥植株表型和GA含量均沒有明顯變化，從而推測GA合成的限速步驟在后續(xù)的催化反應(yīng)。

Ishida等[9]利用來自擬南芥的兼并引物和RT-PCR獲得了普通煙草和等基因的部分序列。作為重要的模式植物和經(jīng)濟(jì)作物，目前煙草和基因尚未被克隆，其在煙草生長發(fā)育中的作用也有待探討。本研究分離了煙草和基因，分析了其進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)特性，為研究其在煙草生長發(fā)育中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為普通煙草品種K326和野生二倍體林煙草、絨毛狀煙草，2012年播種于溫室，自然條件下培養(yǎng)至生殖生長期。分別采集營養(yǎng)生長期的根、莖、葉和生殖生長期的花芽、花。

1.2 基因克隆

使用GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit（Thermo）提取各組織總RNA。采用PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Takara）反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。檢索本氏煙草基因組(http://solgenomics.net/organism/Nicotiana_benthamiana/genome)預(yù)測的cDNA數(shù)據(jù)庫，得到本氏煙草和基因全長CDS，并據(jù)其進(jìn)行相關(guān)基因的引物設(shè)計(jì)（表1），用于擴(kuò)增二倍體煙草和普通煙草和基因的中間片段。PCR擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[10]。將PCR產(chǎn)物檢測回收，連接pmd18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5ɑ。篩選陽性克隆，并送華大基因公司測序。

采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）分別進(jìn)行3’和5’ RACE反應(yīng)。所用基因特異引物GSP和巢式引物NGSP根據(jù)測序中間片段序列設(shè)計(jì)（表1），反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[10]。將RACE產(chǎn)物測序和拼接得到全長cDNA序列。

1.3 多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化和亞細(xì)胞定位分析

采用DNAMAN軟件將得到的煙草和基因與番茄等進(jìn)行多序列比對(duì)分析；利用MEGA 5.0[11]構(gòu)建NJ進(jìn)化樹。采用在線程序TargetP[12]對(duì)煙草和進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

表1 絨毛狀煙草基因克隆和表達(dá)分析的引物及其序列

1.4 熒光定量表達(dá)分析

分別提取K326和林煙草不同生長時(shí)期各組織的總RNA，去除基因組DNA污染后，稀釋到100 ng/μL。按照試劑盒說明，利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time, Takara）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋5倍后利用SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus, Takara）在熒光定量PCR儀ABI 7500上進(jìn)行qRT-PCR分析。所用基因特異引物見表1，以煙草核糖體蛋白基因作為內(nèi)參[10,13]。

2 結(jié) 果

2.1 煙草ga1和ga2基因的分離

利用本氏煙草來源的引物，在普通煙草、絨毛狀煙草和林煙草中都得到了約1300 bp的中間片段，并且利用RACE技術(shù)分別獲得了和基因在3個(gè)煙草種中的全長CDS序列。圖1顯示在絨毛狀煙草中獲得的RACE結(jié)果。

基因5’ RACE獲得了約650 bp的條帶；巢式擴(kuò)增得到一條508 bp的序列；3’ RACE擴(kuò)增得到了1103 bp的序列。根據(jù)序列重疊并去除RACE反應(yīng)加入的接頭序列后，得到了絨毛狀煙草包括UTR全長2836 bp的序列，其中5’ UTR和3’ UTR分別長178 bp和168 bp，編碼區(qū)長2490 bp，編碼829個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。同樣的方法得到了絨毛狀煙草包括UTR全長2852 bp的序列，其中5’ UTR和3’ UTR分別長208 bp和343 bp，編碼區(qū)長2301 bp，編碼769個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。將本氏煙草中預(yù)測的基因命名為/，本實(shí)驗(yàn)克隆的普通煙草、絨毛狀煙草和林煙草的6條序列分別命名為/、/和/（表2）。

圖1 絨毛狀煙草ga1和ga2基因RACE擴(kuò)增結(jié)果

注：M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為5’ RACE擴(kuò)增結(jié)果；2為5’ RACE巢式擴(kuò)增結(jié)果；3為3’ RACE擴(kuò)增結(jié)果。

表2 煙草ga1和ga2基因的序列信息

2.2 多序列比對(duì)和亞細(xì)胞定位分析

將得到的煙草屬序列與番茄相應(yīng)基因編碼的蛋白序列進(jìn)行了多序列比對(duì)（圖2）。較茄科作物番茄，ga1和ga2在煙草屬不同種之間保守性很高。在線程序TargetP預(yù)測結(jié)果表明，煙草ga1和ga2均具有葉綠體定位序列，成熟蛋白定位于葉綠體，參與赤霉素在葉綠體中的合成反應(yīng)（表2）。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

Lee等[14]認(rèn)為普通煙草起源于野生二倍體絨毛狀煙草和林煙草，其天然雜交F1經(jīng)染色體自然加倍成為四倍體煙草。進(jìn)化樹分析顯示（圖3），普通四倍體煙草和與絨毛狀煙草親緣關(guān)系最近，而與林煙草相對(duì)較遠(yuǎn)。其他植物，如番茄、擬南芥、水稻等中均存在其直系同源基因。

注：相同的氨基酸以黑色表示；相似的氨基酸以灰色表示。

圖3 煙草、番茄、擬南芥和水稻ga1和ga2的進(jìn)化分析

2.4 熒光定量表達(dá)分析

熒光定量表達(dá)分析表明（圖4），和在K326和林煙草被檢測的組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量在不同組織存在明顯差異。二者在林煙草莖伸長前期的葉片中表達(dá)量最高；而在莖伸長期時(shí)在莖中的表達(dá)量顯著高于根和葉；在生殖生長期的花芽中的表達(dá)量略高于花。在K326中，在營養(yǎng)生長期的莖表達(dá)量最高，而在根中表達(dá)量最高。

3 討 論

在葉綠體中，ga1和ga2催化的合成反應(yīng)是赤霉素代謝的必經(jīng)途徑，其發(fā)生突變最直接的表型是植株矮化[5-6]。這種作用在以農(nóng)作物如小麥、水稻等矮化育種為主導(dǎo)的第二次綠色革命中起到了重要作用[1,15-19]。煙草作為重要的模式植物，其相關(guān)基因的研究鮮有報(bào)道。本研究利用同源克隆和RACE技術(shù)，獲得了煙草屬3個(gè)種和基因類似物的全長CDS序列，包括普通煙草及其可能的起源種絨毛狀煙草和林煙草。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的煙草和類似物的序列與Ishida等[9]獲得的普通煙草和的部分序列基本一致，說明本研究獲得了幾種煙草的相關(guān)基因序列。

圖4 煙草ga1和ga2在林煙草和普通煙草K326中的熒光定量表達(dá)分析

注：a和b分別為（上）和（下）在林煙草和普通煙草K326中的相對(duì)表達(dá)量。a（1~8）分別為林煙草莖伸長前期的根（1）、莖（2）、葉（3）；莖伸長期的根（4）、莖（5）、葉（6）；生殖生長期的花芽（7）、花（8）。b（1~5）分別為普通煙草K326營養(yǎng)生長期的根（1）、莖（2）、葉（3）；生殖生長期的花芽（4）、花（5）。

通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可以分析分子間的起源關(guān)系。通常認(rèn)為，普通煙草由野生二倍體絨毛狀煙草和林煙草的天然雜交F1經(jīng)染色體加倍形成[14,20]。由此，可以推測普通煙草較野生二倍體煙草存在和基因的二份拷貝，一個(gè)起源于絨毛狀煙草，一個(gè)起源于林煙草。Prisic等[21]研究證實(shí)，水稻中存在兩個(gè)CPS編碼基因，但其功能已經(jīng)發(fā)生了分化，一個(gè)參與赤霉素合成，另一個(gè)則參與次級(jí)代謝，生成具有防御功能的化學(xué)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，在普通煙草K326中克隆了兩個(gè)基因的各一個(gè)拷貝，且其與絨毛狀煙草中相應(yīng)基因的親緣關(guān)系最近。作者推測，普通煙草中可能還存在起源于林煙草的基因拷貝或者同源物，這份冗余的拷貝是否在進(jìn)化中丟失了功能或者行使不同于赤霉素合成的功能，有待于進(jìn)一步鑒定。

林煙草較普通煙草和絨毛狀煙草在植株生長發(fā)育中存在較大差異。林煙草在生長發(fā)育早期呈“匍匐狀”，即莖不伸長，到營養(yǎng)生長后期和生殖生長前期，其莖開始生長；而普通煙草和絨毛狀煙草的生長發(fā)育一直伴隨著莖的伸長。推測可能與GA代謝相關(guān)。因此，本研究對(duì)林煙草和普通煙草和基因進(jìn)行了不同發(fā)育時(shí)期的熒光定量表達(dá)分析。結(jié)果表明，在林煙草生長發(fā)育早期其主要在葉片中表達(dá)，在莖伸長期莖中的表達(dá)量則顯著高于根和葉片。已知GA的一個(gè)生理效應(yīng)是能加速細(xì)胞伸長，從而促進(jìn)植物的營養(yǎng)生長，尤其能顯著促進(jìn)莖和葉的生長。林煙草生長發(fā)育早期莖不伸長，主要是葉片的生長；到營養(yǎng)生長后期和生殖生長前期則主要是莖的伸長。這與GA代謝基因在林煙草不同發(fā)育階段不同組織器官中的表達(dá)量基本一致。

進(jìn)一步研究可以繼續(xù)篩選普通煙草中起源于林煙草和基因的直系同源序列，分析序列和功能其是否已發(fā)生變化；結(jié)合RNAi、過表達(dá)和原核表達(dá)等技術(shù)研究其在煙草中的功能。

4 結(jié) 論

本研究利用RACE技術(shù)從3個(gè)煙草種中克隆了GA合成相關(guān)基因和，均被預(yù)測定位于葉綠體；序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)煙草屬中相關(guān)基因高度保守；進(jìn)化樹分析顯示，普通煙草中克隆的和可能來源于絨毛狀煙草；表達(dá)分析表明，相關(guān)基因的表達(dá)與林煙草的生長發(fā)育狀態(tài)基本一致。

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Cloning and Expression Analysis ofandin Tobacco

DING Anming1,2, CHEN Yaqiong1,2, Zahid Hussain1,2, KANG Le1,2, ZHANG Yunrui1,2, CUI Mengmeng1, WANG Qian1, SUN Yuhe1*

(1. Key laboratory for tobacco gene resources, Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266100, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Two GA metabolism related genesandwere cloned by using homology-based method and RACE from three tobacco species to explore the role in which gibberellic acids (GA) play in tobacco growth and development. Based on sequence alignment, a phylogenetic tree was constructed. qRT-PCR was executed to detect the gene expression profiles inand. The results showed that they were highly conserved in sequences inplants and genes inmight originate from. qRT-PCR analysis showed thatandwere expressed in much higher levels in leaves of stage before stem elongation and in stem of the stem elongation stage than other tissues in.

tobacco; gibberellic acid; qRT-PCR

TS413

1007-5119（2014）01-0102-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.019

丁安明，男，博士研究生，主要從事煙草功能基因組學(xué)研究。E-mail：anmingdsdau@163.com。

通信作者，E-mail：yhsun@163.com

2013-06-06

2013-11-14