朱雯婷，梁小鳳，饒進(jìn)軍，王文雅

（南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理研究所，廣東廣州 510515）

帕金森（Parkinson’s disease，PD）是中、老年人常見(jiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)錐體外系功能障礙的慢性進(jìn)行性疾病。其主要病理表現(xiàn)是黑質(zhì)多巴胺（DA）神經(jīng)元選擇性變性死亡，中樞神經(jīng)遞質(zhì)DA含量減少［1］。導(dǎo)致這一病理改變的確切病因目前仍不清楚，可能是多種因素共同作用的結(jié)果。研究表明，神經(jīng)元凋亡在PD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用［2］。因此，研究神經(jīng)元凋亡的信號(hào)通路將為揭示神經(jīng)元凋亡提供一個(gè)理論基礎(chǔ)。多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，如c-Jun氨基末端激酶通路［3］、細(xì)胞周期再激活、p53的激活［4］、Bcl-2家族蛋白以及通過(guò)GSK-3／Tau通路的信號(hào)通路等介導(dǎo)了PD黒質(zhì)神經(jīng)元凋亡。Tau磷酸化是多條PD相關(guān)神經(jīng)元凋亡信號(hào)通路的匯合點(diǎn)［5］，Tau蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的微管相關(guān)蛋白，其功能受磷酸化調(diào)節(jié)。在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）／1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP＋）誘導(dǎo)的PD模型中（離體的細(xì)胞模型和整體的動(dòng)物模型），黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)Tau蛋白（Ser396）異常磷酸化［6］。

既然Tau磷酸化與PD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，并且有研究表明抑制Tau磷酸化可以減少神經(jīng)元的凋亡［7］。我們篩選了一系列能夠抑制Tau磷酸化的化合物，發(fā)現(xiàn)6-羥基-1H-吲唑具有神經(jīng)保護(hù)作用。6-羥基-1H-吲唑是一種有機(jī)化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如Fig 1所示。用MPP＋作用于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SHSY5Y制作PD的細(xì)胞模型，觀察6-羥基-1H-吲唑?qū)PP＋誘導(dǎo)凋亡的SH-SY5Y細(xì)胞是否具有作用，并探討其可能的機(jī)制。

Fig 1 Structure of 6-Hydroxy-1H-indazole

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室惠贈(zèng)。

1.2 藥品 高糖 DMEM（Dulbecco’smodified eagle medium）培養(yǎng)基購(gòu)自 Hyclone。6-羥基-1H-吲唑、Hoechst33258、四氮唑鹽（MTT）、MPP＋均購(gòu)自 Sigma，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，6-羥基-1H-吲唑用DMSO溶解，配成100×的儲(chǔ)備液，直接加到培養(yǎng)基中，使終濃度分別為 0.001、0.01、0.1、1、10和100μmol·L－1。MPP＋用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基配成100×1 mmol·L－1儲(chǔ)備液，加到培養(yǎng)基中。

1.3 抗體 特異性磷酸化Tau（Ser396）的羊多克隆抗體和特異性酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）的兔多克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz。

1.4 儀器 CO2組織培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma Scientific公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州儀器四廠）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppenddorf公司）；酶標(biāo)儀（BIO-RAD公司）；電泳儀（BIO-RAD公司）；半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD公司）。

1.5 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。消化傳代接種在96或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的6-羥基-1H-吲唑，2 h后加入 MPP＋，培養(yǎng)48 h之后，按文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行，以MTT法檢測(cè)6-羥基-1H-吲唑?qū)?SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用；以 Hoechst33258染色法［8］觀察 6-羥基-1H-吲唑?qū)?xì)胞核典型凋亡形態(tài)學(xué)的影響；以ABC法觀察6-羥基-1H-吲唑?qū)?xì)胞內(nèi)TH含量的影響；MPP＋處理8 h后，做TH和磷酸化Tau的免疫熒光雙染［9］，觀察6-羥基-1H-吲唑?qū)PP＋誘導(dǎo)的Tau過(guò)磷酸化的影響。在倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)拍照。

1.6 免疫印跡 棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞2次，每孔加入細(xì)胞裂解液 SDS 2 g、Tris堿0.7571 g、溴酚藍(lán) 0.01 g、DTT 0.771 g、去離子水 90 ml、甘油10ml150μl冰面上裂解20 min，超聲粉碎DNA 12 s后，（95～100）℃水浴中煮沸5 min，冷卻后置于高速離心機(jī)以4℃、12 000 r·min－1離心10 min?？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉1 h后加入用封閉液稀釋的一抗4℃過(guò)夜，d 2取出室溫孵育二抗2 h，ECL顯色液兩種顯色底物1∶1等體積混合顯色，壓膠片曝光，β-actin作為內(nèi)參照。掃描膠片，運(yùn)用gerpro analyzer對(duì)Western blot條帶進(jìn)行半定量分析，目的蛋白的條帶的密度與β-actin相比，用相對(duì)光密度（relative optical density，ROD）來(lái)表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以ˉx±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 MPP＋濃度依賴(lài)性地誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

MPP＋對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性成濃度依賴(lài)性，在200μmol·L－1MPP＋作用 SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，與空白組細(xì)胞相比，其細(xì)胞存活率降至（47.80±0.84）%（P＜0.01）（Fig 2）。

Fig 2 MPP＋induces SH-SY5Y cells apoptosis in a dose-dependentmannerCells were treated with various concentrations（0.002～1 mmol·L－1）of MPP＋for 48 h.The cell viability was analyzed by the conventional MTT reduction assay.**P＜0.01 vs control.

2.2 MPP＋誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi) Tau蛋白過(guò)度磷酸化 Western bolt結(jié)果顯示 200μmol·L－1MPP＋處理2 h之后，p-Tau（Ser396）水平開(kāi)始升高，在8 h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。表明MPP＋作用SH-SY5Y細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致Tau蛋白過(guò)度磷酸化（Fig 3）。

Fig 3 MPP＋induces hyperphosphorylation of Tau（Ser396）in cultured SH-SY5Y cellsSH-SY5Y cellswere treated with 200μmol·L－1 MPP＋ for 0，2，4，8，16 and 24 h respectively.The levels of p-Tau（Ser396）were detected by Western blotwith the specific antibodies.**P＜0.01 vs control group.

2.3 6-羥基-1H-吲唑?qū)?MPP＋誘導(dǎo)凋亡的 SHSY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用 提前2 h加入0.001、0.01、0.1、1、10和 100μmol·L－16-羥基-1H-吲唑，200μmol·L－1MPP＋孵育48 h，細(xì)胞存活率與空白組 相 比 分 別 為 （70.36±0.36）%、（67.86±3.77）%、（67.57±3.11）%、（63.84±1.43）%、（61.22±0.54）%和（59.86±1.34）%（P＜0.01）（Fig 4A）。用ABC法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)殘余多巴胺神經(jīng)元的數(shù)目，與溶劑對(duì)照組相比，MPP＋導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元大量丟失，而0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑會(huì)明顯的抑制因MPP＋毒性所引起的TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的減少（Fig 4C，D）。0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑在不加MPP＋的情況下單獨(dú)作用于細(xì)胞，與空白組相比細(xì)胞存活率的改變沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 4B）。

2.4 6-羥基-1H-吲唑?qū)?MPP＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡具有抑制作用 用Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的凋亡情況。在溶劑對(duì)照組內(nèi)，細(xì)胞核形態(tài)正常（Fig 5A）。在200μmol·L－1MPP＋處理48 h之后，引起了細(xì)胞核體積縮?。ò咨^顯示核固縮）（Fig 5B），在用0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑預(yù)處理2 h之后，核固縮明顯減輕（Fig 5C）。

2.5 6-羥基-1H-吲唑?qū)?MPP＋誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白過(guò)磷酸化水平的影響 免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)在溶劑對(duì)照組，TH-陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)有微弱p-Tau（Ser 396）的表達(dá)，雙染的SH-SY5Y細(xì)胞呈現(xiàn)黃色；MPP＋處理8 h后，TH-陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi) p-Tau（Ser396）水平明顯升高，雙染細(xì)胞顯示橙紅色；0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑預(yù)處理 2 h后，細(xì)胞內(nèi) p-Tau（Ser396）水平明顯下降，雙染細(xì)胞顯示黃色（Fig 6）。

Western blot的結(jié)果顯示 MPP＋處理8 h后，0.1 μmol·L－16-羥基-1H-吲唑使細(xì)胞內(nèi) p-Tau（Ser396）表達(dá)水平與MPP＋組比較明顯降低（Fig 7）。

Fig 4 Effect of 6-Hydroxy-1H-indazole on MPP＋-induced decrease in SH-SY5Y cell viabilityA：Cell viability exposed to MPP＋ with or without6-hydroxy-1H-indazole.Cells were pretreated with various concentrations（0.001-100μmol·L－1）of6-hydroxy-1H-indazole for2 h and then treated with 200μmol·L－1 MPP＋for48 h；B：Cellswere treated with 200μmol·L－1 MPP＋in absence or presence of0.1μmol·L－1 6-hydroxy-1H-indazole for 48 h as described；C：Quantification of TH-positive cellswas carried outas described in the Materials and Methods；D：Immunocytochemistry staining of TH-positive cells，a）vehicle treated（control）；b）MPP＋treated；c）along with 6-hydroxy-1H-indazole 0.1μmol·L－1.Note themarked reduction in TH-positive cell after treated with 200μmol·L－1 MPP＋.6-hydroxy-1H-indazole at 0.1μmol·L－1 significantly protected TH-positive neurons from death induced by MPP＋ exposure（×200）.＃＃P＜0.01 vs control；**P＜0.01 vs MPP＋.

3 討論

PD是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，PD患者的黑質(zhì)致密部會(huì)出現(xiàn)路易小體和路易神經(jīng)突起，多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生凋亡。路易小體最初是在神經(jīng)纖維纏結(jié)中被發(fā)現(xiàn)的，聚集的過(guò)磷酸化的Tau蛋白是神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分，構(gòu)成毒性分子，可獵獲神經(jīng)元中其他正常的微管蛋白，使微管結(jié)構(gòu)崩解，神經(jīng)元退變［10］，推測(cè)Tau蛋白磷酸化和PD黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡有一定的關(guān)系。在PD患者的腦部神經(jīng)突觸富集的地方發(fā)現(xiàn)Tau的Ser396位點(diǎn)過(guò)度磷酸化，同時(shí)伴隨著α-突觸核蛋白的磷酸化［11］，進(jìn)一步確定Tau蛋白磷酸化在PD的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。

Fig 5 Nuclear-stained figures of 6-Hydroxy-1H-indazole inhibitory effect on SH-SY5Y cells apoptosis induced by MPP＋A：Control，vehicle-treated cells；B：200μmol·L－1 MPP＋induced apoptosis；C：Alongwith 6-Hydroxy-1H-indazole0.1μmol·L－1.Note nuclear condensation and heterochramatin clumping，the typical apoptotic morphology in b，but few in a and c（×200）.

Fig 6 6-Hydroxy-1H-indazole attenuates MPP＋-induced hyperphosphorylation of Tau（Ser396）in cultured SH-SY5Y cellsDetection of p-Tau（Ser396）expression by immunocytochemicalwas at8 h after MPP＋treatment in cultured SH-SY5Y cells.Specific TH-antibody was used to detect dopaminergic neurons.Vehicle-treated cultures showed low phosphorylative levels on Tau（Ser396）（red）in TH positive cells.Note more Tau（Ser396）were phosphorylated in MPP＋treated cells，resulting in neurons stainingwith salmon pink（white arrow），and MPP＋-increased Tau（ser396）phosphorylation in TH positive neurons could be prevented by 0.1μmol·L－1 6-Hydroxy-1H-indazole（×200）.

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y是一種具有多巴胺能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元特征的細(xì)胞［12］。TH是一種非血紅素鐵蛋白，體內(nèi)TH主要分布于中樞兒茶酚胺（catecholamines，CA）能神經(jīng)元、外周交感神經(jīng)節(jié)非腎上腺素能神經(jīng)元、交感神經(jīng)纖維、腎上腺髓質(zhì)非腎上腺素能和腎上腺素能細(xì)胞。在腦內(nèi)，TH催化CA類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)體內(nèi)合成的起始步驟，即L-酪氨酸羥化形成 L-多巴（L-DOPA）的反應(yīng)。與參與CA合成步驟的其他催化酶相比，TH含量最少、合成速率最低、催化活性最弱且底物專(zhuān)一性最強(qiáng)，因而被認(rèn)為是包括DA在內(nèi)的CA合成的限速酶。TH同時(shí)還是腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的蛋白標(biāo)志，TH免疫組織化學(xué)方法（TH-IR）常被用于顯示DA能神經(jīng)元細(xì)胞體及其突起。因此我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用TH的免疫細(xì)胞化學(xué)方法標(biāo)示SH-SY5Y細(xì)胞。大量研究證實(shí)動(dòng)物注射MPTP可以復(fù)制出黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性退化的過(guò)程，并且出現(xiàn)PD類(lèi)似的行為和病理特征，同時(shí)其活性代謝產(chǎn)物MPP＋能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元凋亡，所以現(xiàn)在MPP＋體外作用于SH-SY5Y細(xì)胞已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于藥物篩選［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MPP＋可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞的存活率降低，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，IC50為（193±3.1）μmol·L－1，其中 200μmol·L－1的 MPP＋作用SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的存活率為（47.80±0.84）%（P＜0.01），因此選取 48 h和 200μmol·L－1MPP＋作用于SH-SY5Y細(xì)胞作為PD的細(xì)胞模型。

Fig 7 6-Hydroxy-1H-indazole decreases p-Tau（Ser396）which was increased by MPP＋SH-SY5Y cells were treated with 200μmol·L－1 MPP＋ for 8 h.The levels of p-Tau（Ser396）were detected by Western blot with the specific antibodies.＃＃P＜0.01 vs control；**P＜0.01 vs MPP＋.

我們?cè)谙惹暗膶?shí)驗(yàn)中亦證實(shí)，色霉素A3（chromo-mycin A3）是一個(gè)抗癌藥物，抑制 Tau（Ser396）磷酸化，進(jìn)而抑制MPP＋誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元的凋亡［14］。特異性的GSK-3β抑制劑ARA014418可降低Tau磷酸化，對(duì)PD動(dòng)物起治療作用［9］。研究也發(fā)現(xiàn)，Rho激酶 （ROCK）抑制劑通過(guò)抑制CDK5對(duì)Tau的磷酸化而改善全腦缺血模型鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶能力［15］。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：抑制Tau蛋白磷酸化可以減少神經(jīng)元的凋亡。因此我們通過(guò)美國(guó)一個(gè)專(zhuān)利（US7629374B2，USE OF AMINOINDAZOLE DERIVATIVES FOR THE INHIBITION OF TAU PHOSPHORYLATION），選擇一些結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，篩選發(fā)現(xiàn)氨基吲唑衍生物能夠抑制Tau蛋白磷酸化，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)6-羥基-1H-吲唑的保護(hù)作用。用 0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑作用 SHSY5Y細(xì)胞2 h后再孵育MPP＋48 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的存活率明顯增高，為（63.84±1.43）% （P＜0.01）。同時(shí)細(xì)胞單獨(dú)用 0.1μmol·L－16-羥基-1H-吲唑在不加MPP＋情況下作用，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞的存活率與溶劑對(duì)照組間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明藥物本身沒(méi)有毒性。TH的ABC染色發(fā)現(xiàn)，在單獨(dú)MPP＋作用的組別，TH陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，而用0.1 μmol·L－16-羥基-1H-吲唑作用的組別均可保護(hù)性干預(yù)MPP＋對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性，減少TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的死亡。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，單用MPP＋組的細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的顆粒塊狀熒光，而在用6-羥基-1H-吲唑處理的細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞呈彌散的均勻熒光，說(shuō)明6-羥基-1H-吲唑能明顯的減輕MPP＋誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Western blot免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)200μmol·L－1的MPP＋會(huì)引起 p-Tau（Ser396）蛋白的水平升高，2 h、4 h水平逐步升高，在8 h時(shí)達(dá)到頂峰，然后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)反而降低。因此選擇MPP＋作用于SHSY5Y細(xì)胞8 h這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用酪氨酸羥化酶（TH）和p-Tau（Ser396）的熒光雙染進(jìn)一步來(lái)證實(shí)，6-羥基-1H-吲唑?qū)H陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)Tau（Ser396）的磷酸化水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6-羥基-1H-吲唑可以明顯地降低TH-陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)Tau（Ser396）的磷酸化，從而對(duì)MPP＋誘導(dǎo)凋亡的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上所述，MPP＋誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡伴隨著Tau的過(guò)磷酸化，而6-羥基-1H-吲唑可明顯對(duì)抗MPP＋的神經(jīng)毒作用，并且抑制了Tau磷酸化。這提示：通過(guò)藥物干擾改變Tau蛋白的磷酸化水平可能是治療PD的一種新策略，而6-羥基-1H-吲唑可以發(fā)揮這樣的作用。我們計(jì)劃繼續(xù)研究6-羥基-1H-吲唑抑制Tau磷酸化的機(jī)制，并且通過(guò)用MPTP注射動(dòng)物來(lái)制造PD動(dòng)物模型，觀察6-羥基-1H-吲唑是否能夠降低MPTP對(duì)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損耗，并且改善行為學(xué)的損傷，由此進(jìn)一步證明，6-羥基-1H-吲唑是一個(gè)可以通過(guò)調(diào)節(jié)Tau蛋白的代謝來(lái)達(dá)到治療效果的化學(xué)物質(zhì)。

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