金敏娜，林欣大

(中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江省生物計量與檢驗檢疫重點實驗室，杭州 310018)

1 保幼激素(Juvenile Hormone，JH)及其受體

保幼激素(Juvenile Hormone，JH)是由昆蟲咽側(cè)體分泌的重要激素［1］，其主要功能包括保持幼蟲的特性、維持前胸腺和促進(jìn)卵巢成熟，調(diào)控昆蟲的發(fā)育、變態(tài)和生殖等過程［2-4］。近年來隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，一些國內(nèi)外研究團(tuán)隊以果蠅(Drosophila melanogaster)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)和德國小蠊(Blattella germanica)等為研究對象，借助RNA干擾和蛋白互作等技術(shù)在JH受體鑒定、JH調(diào)控昆蟲胚后發(fā)育、生殖過程及JH與蛻皮激素(Ecd)的相互作用等方面做了大量的研究工作。例如，在紅椿(Pyrrhocoris apterus)中，JH可以阻止由Ecd引起的幼蟲變態(tài)，從而維持蛻皮后的幼蟲狀態(tài)。在沙蟋(Gryllus firmus)的研究中，發(fā)現(xiàn)JH與沙蟋的翅型分化有關(guān)。戴華國等還通過褐飛虱(Nilaparvata lugens)若蟲體背點滴保幼激素類似物烯蟲酯(Methoprene)來證實褐飛虱翅型分化的敏感期是3齡末4齡初［5］。但Daimon等在家蠶(Bombyx mori)的dimolting(mod)突變體(缺少P450環(huán)氧酶而不能合成JH)中，發(fā)現(xiàn)在2齡幼蟲過后仍能發(fā)育成為早熟蛹［6］。這個結(jié)果暗示家蠶早期低齡幼蟲對保幼激素缺失不敏感，因此，JH可能還有其他功能或作用機(jī)制［7］。

1.1 JH受體

了解保幼激素分子作用的機(jī)制，很大程度上受限于JH受體的鑒定。在過去的20多年里國內(nèi)外研究者對JH受體的克隆與鑒定做了大量的實驗和研究［8-9］。

早在1986年Wilson等在Met突變體果蠅對JH抗性研究中，發(fā)現(xiàn)過量的JH處理可以誘導(dǎo)果蠅幼蟲生成假瘤(pseudotumor)，而Met突變體對這種誘導(dǎo)作用的耐受能力遠(yuǎn)比正常果蠅強(qiáng)［10］。methoprenetolerant(Met)屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子基因家族［11-12］，在果蠅對保幼激素類似物烯蟲酯的抗性研究中，也有發(fā)現(xiàn)Met突變體對烯蟲酯的耐受能力比正常果蠅強(qiáng)［13］，并且Met突變體抑制烯蟲酯誘導(dǎo)功能的發(fā)揮，制約雌性果蠅卵黃發(fā)育。Miura等人研究表明JH能強(qiáng)烈而特異性地結(jié)合Met，并迅速誘導(dǎo)Met進(jìn)行轉(zhuǎn)錄［14］。離體轉(zhuǎn)錄翻譯的果蠅Met與JHIII有生理水平上的親和力，反之JHIII也可以誘導(dǎo)Met進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯合成JH受體蛋白Met。以上結(jié)果表明Met是最有可能的JH受體。

然而Pursley等發(fā)現(xiàn)Met基因缺失的突變體果蠅除了產(chǎn)卵延后、生殖力下降以外，胚后發(fā)育一切正常，這就與Met作為JH受體應(yīng)有的表型相矛盾的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Met有一個旁系同源基因Germ cellexpressed(Gce)［15］。Met和 Gce具有部分的功能重疊性，Gce能明顯提高M(jìn)et突變體對烯蟲酯的敏感性，只有兩個基因的雙突變體才會有致死性［16］，并且Gce與JHIII也有生理水平上的親和力［17］。此外，對赤擬谷盜Met基因進(jìn)行RNA干擾發(fā)現(xiàn)化蛹提前而形成早熟蛹，這種表型與JH缺失的表型相似，也為Met是JH受體的說法提供有力的證據(jù)［18］。就目前而言，JH 受體包括 Met和 Gce［19-20］。

1.2 JH受體相關(guān)蛋白

在果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)bHLH-PAS(basic Helix-Loop-Helix-Per/Arnt/Sim)與核受體(如Met和Gce)結(jié)合形成異源二聚體，作為主要成分參與保幼激素信號通路［19，21-22］。在伊蚊(Aedes)的研究中發(fā)現(xiàn)MET和cycle(CYC)都屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子，兩者結(jié)合形成的二聚體，再與bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄激活物steroid receptor coactivator(SRC/FISC)結(jié)合形成MET/CYC/FISC聚合物，將JH信號傳遞給下游應(yīng)答基因Kr-h1和 Hairy，從而引起幼蟲的生理反應(yīng)［11］。Sang等猜想 MET可以招募不同的DNA結(jié)合域bHLH-PAS 來發(fā)揮作用［11］。

2 Kr-h1基因

JH從咽側(cè)體分泌后，與載體蛋白形成復(fù)合體，經(jīng)血循環(huán)到達(dá)細(xì)胞核，與核受體(Met、Gce等)或相關(guān)復(fù)合物特異性結(jié)合，進(jìn)而對JH信號進(jìn)行轉(zhuǎn)換并啟動細(xì)胞內(nèi)特定基因Krüppel-homolog 1(Kr-h1)轉(zhuǎn)錄，最終影響昆蟲生長發(fā)育和引起相關(guān)形態(tài)等的變化［23］。早在 1896年，Schuh等在果蠅中發(fā)現(xiàn)了Krüppel(Kr)基因，該基因編碼的蛋白是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，并且通過原位雜交在果蠅基因組和真核生物中發(fā)現(xiàn) Krüppel有多種同源基因(Krüppel-homologous gene)，經(jīng)過克隆、分析及鑒定，結(jié)果顯示Krüppel-homologous gene具有調(diào)控果蠅生長發(fā)育的作用［24］。后來在果蠅研究中的表明Kr-h1基因參與JH信號傳導(dǎo)途徑，并發(fā)揮其生理功能。隨后鑒定了JH受體Met和Gce，并且發(fā)現(xiàn)Kr-h1處于它們的下游，從而逐步形成了JH-Met(協(xié)同Gce)-Krh1調(diào)控模式，開始了Kr-h1研究的新篇章，被廣泛應(yīng)用于全變態(tài)和不全變態(tài)昆蟲的研究中。Kr-h1基因影響神經(jīng)細(xì)胞分化，調(diào)控胚胎、蛻皮等發(fā)育過程，球菜葉蛾(Agrotis ipsilon)AiKr-h1基因與雄性幼蟲的性行為成熟密切相關(guān)，借助德國小蠊(Blattella germanica)Kr-h1基因，可以探索昆蟲不全變態(tài)發(fā)育和全變態(tài)發(fā)育的差異［25］。

近年來對Kr-h1的研究逐漸增多，除了家蠶、黑腹果蠅、蜜蜂(Apis mellifera)和赤擬谷盜之外，通過NCBI檢索還發(fā)現(xiàn)了瘧蚊(Anopheles gambiae)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)、紅火蚊(Solenopsis invicta)、擬暗果蠅(Drosophila pseudoobscura)、螞蟻(Camponotus floridanus)、吸血紅椿(Rhodnius prolixus)［23］、紅椿(Pyrrhocoris apterus)［23］、熊蜂(Bombus terrestris)、苜蓿切葉蜂(Megachile rotundata)、球菜夜蛾［26］等昆蟲均有 Kr-h1或 Kr-h1同源基因。

2.1 Kr-h1基因的結(jié)構(gòu)

最早是從果蠅中分離出了Kr-h1的突變體等位基因，分別是kr-h2—kr-h5，發(fā)現(xiàn)這些基因都是蛹致死因子，與kr-h1并沒有互補(bǔ)關(guān)系，突變位點位于遠(yuǎn)離Kr-hα啟動子或者在第一個內(nèi)含子的起始端［27］。

早在1986年，Schun等人就提出Kr-h1翻譯后的氨基酸是一種含有2個Cys和2個His的鋅指結(jié)構(gòu)，Kr-h1基因的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在可變剪接，主要有 3 種剪接產(chǎn)物:Kr-h1α、Kr-h1β 和 Kr-h1λ［24］。Krh1α和Kr-h1λ主要調(diào)控昆蟲的蛹期變態(tài)及幼蟲-蛹的過程［28］;而Kr-h1β在胚胎中含量極其豐富，在昆蟲的胚胎發(fā)育及卵-幼蟲的發(fā)育過程中起到主要調(diào)控作用［27，29］。現(xiàn)有研究表明Kr-h1蛋白是一種含C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，處于保幼激素受體Met下游。根據(jù)NCBI上的信息，查詢結(jié)果顯示目前為止擁有完整的8個鋅指結(jié)構(gòu)(Zn1—Zn8)的Kr-h1基因共有18個。將這18個Kr-h1基因和克隆的褐飛虱Krh1翻譯后進(jìn)行氨基酸序列比對(圖1)，結(jié)果顯示8個鋅指結(jié)構(gòu)保守性存在明顯差異，Zn1和Zn8的保守性較低，Zn2—Zn7的保守性相對較高。此外8個鋅指的長短差別很大，尤其是Zn4特別短，其次是Zn7(圖1)。

圖1 Kr-h1蛋白8個鋅指結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenic analysis of 8 Zinc fingers from Kr-h1 protein

此外，還找到了兩個Kr-h1全長基因，分別是人頭虱(Pediculus humanus corporis)的PhcKr-h1基因和麗蠅蛹集金小蜂的(Nasonia vitripennis)NvKr-h1基因。將這兩個基因翻譯成氨基酸后與上述的19種Kr-h1蛋白進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有所有Kr-h1蛋白均有Zn4，因此猜想該鋅指的功能最為普遍，此外還發(fā)現(xiàn)人頭虱的Kr-h1蛋白除了Zn7外其余鋅指都有，而麗蠅蛹集金小蜂的Kr-h1蛋白只有Zn4和Zn7(圖2)。非常有意思的是人頭虱和麗蠅蛹集金小蜂都屬于寄生類昆蟲，所以推測Kr-h1基因的鋅指結(jié)構(gòu)可能在這兩種昆蟲的長期進(jìn)化過程中出現(xiàn)部分退化，表現(xiàn)出Kr-h1鋅指蛋白個數(shù)的缺失，從另一方面來說，也可能8個鋅指結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)上有一定的冗余性?？偠灾?，根據(jù)Kr-h1鋅指蛋白基因的分布情況分析不同物種Kr-h1的差異，有助于更清晰地了解該基因的結(jié)構(gòu)功能與特點。

圖2 Kr-h1蛋白鋅指分布圖Fig.2 Zinc fingersdistribution of Kr-h1 proteins

2.2 Kr-h1基因的功能

研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅［27］、赤擬谷盜［30］等全變態(tài)發(fā)育昆蟲的胚胎期和幼蟲期，Kr-h1基因胚胎發(fā)育和胚后幼蟲蛻皮發(fā)育過程中表達(dá)比較活躍，蛹期則幾乎消失或不表達(dá)。在西花薊馬(Frankiniella occidentalis)［31］、德國小蠊［32］等不全變態(tài)發(fā)育昆蟲中，Kr-h1基因在胚胎和早期若蟲期表達(dá)活躍，在若蟲末期表達(dá)非常低。因此在昆蟲成蟲即將形成的分界段，Kr-h1的表達(dá)非常低甚至消失，暗示該基因的主要功能發(fā)揮在胚胎及幼蟲(或若蟲)時期。

迄今為止有關(guān)Kr-h1基因的功能研究主要集中在以下幾個方面:調(diào)控昆蟲生長發(fā)育、促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的形成以及影響蜜蜂的覓食行為和雄性球菜夜蛾的性行為成熟(表1)。

2.2.1 調(diào)控生長發(fā)育及變態(tài)

近年來，通過各種分子生物學(xué)手段探究該基因的功能。通過熒光定量PCR技術(shù)檢測Kr-h1在果蠅的胚胎及早期幼蟲生長發(fā)育階段的表達(dá)水平，結(jié)果顯示該基因的表達(dá)量在胚胎和幼蟲中表達(dá)量高，并且DmKr-h1在變態(tài)發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用［27-28，33］。也有大量研究表明 DmKr-h1通過 JH 受體Met和Gce傳遞保幼激素信號，維持幼蟲形態(tài)，調(diào)控幼蟲的生長發(fā)育與變態(tài)［16，19］。

Hiroto等在家蠶(Bombyx mori)的研究中發(fā)現(xiàn)Kr-h1基因在家蠶的4齡末5齡初時期(V0)表達(dá)量很高，在5齡后1d(V1)時期表達(dá)量低下，在5齡后2d(V2)時期表達(dá)量更低［34］。隨著家蠶幼蟲的不斷發(fā)育，BmKr-h1的表達(dá)明顯下降，這說明BmKr-h1具有調(diào)控幼蟲生長發(fā)育的功能。有實驗者通過對赤擬谷盜和西花薊馬的研究來初步分析Kr-h1基因在完全變態(tài)發(fā)育和不完全變態(tài)發(fā)育兩類昆蟲中的功能［32］。赤擬谷盜的生長發(fā)育屬于完全變態(tài)發(fā)育，TcKr-h1的功能類似于DmKr-h1和BmKr-h1，起到調(diào)控胚胎發(fā)育、早期幼蟲生長發(fā)育及后期變態(tài)過程的作用［30，35］。西花薊馬Kr-h1在胚胎期轉(zhuǎn)錄水平非常高，幼蟲和前蛹期較低，蛹期則相當(dāng)?shù)?，這表明FoKrh1可能在胚胎、幼蟲及蛹等階段起著調(diào)控作用［31］。

此外，不少研究者通過改變外源保幼激素或保幼類似物的濃度來處理家蠶早期幼蟲，引發(fā)幼蟲額外蛻皮形成超齡幼蟲或提前成熟化蛹［28］。從分子水平上來說，家蠶的這些形態(tài)變化與Kr-h1的變化有關(guān)，即Kr-h1的表達(dá)水平在一定程度上決定了幼蟲的蛻皮與變態(tài)發(fā)育。用吡丙醚(pyriproxyfen)處理家蠶幼蟲，前蛹和早期蛹雖然能發(fā)育成蛹但最終死亡［31］。利用RNAi技術(shù)將德國小蠊倒數(shù)第二齡或第三齡若蟲的Kr-h1表達(dá)水平下調(diào)，結(jié)果導(dǎo)致早熟成蟲的形成［32，36］。

表1 Kr-h1基因的功能Table 1 Function ofKr-h1 gene

在褐飛虱的Kr-h1研究中發(fā)現(xiàn)，NlKr-h1在胚胎、1齡及2齡若蟲中的表達(dá)量相對較高(Jin等未發(fā)表資料)。利用RNAi技術(shù)將3齡若蟲的 NlKr-h1沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成蟲的足、翅和生殖器發(fā)育明顯異常。此外NlKr-h1在大腦、翅、中腸及卵巢中表達(dá)活躍，推測NlKr-h1在胚胎發(fā)育、若蟲生長及成蟲成熟具有重要的調(diào)控作用。

2.2.2 促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞形成

有研究表明，Kr-h1參與果蠅幼體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，促使光感受器的發(fā)育和成熟［37］。在果蠅幼體的蘑菇體神經(jīng)元細(xì)胞中，無論是處于初始分化階段還是神經(jīng)突形成階段，DmKr-h1表達(dá)量均下調(diào)，這表明神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生時期DmKr-h1表達(dá)下調(diào)為其正常發(fā)育所需［37］。Duportets等人在球菜夜蛾雄性蟲體的研究中發(fā)現(xiàn)，AiKr-h1在不同組織中均有不同程度的表達(dá)，其中在腿部、胸部、大腦、觸角葉中的表達(dá)量比觸角、翅膀及腹部中高，尤其在腦部表達(dá)較高，因此懷疑AiKr-h1與幼體神經(jīng)元形成有一定聯(lián)系［26］。

2.2.3 影響行為

Fussnecker等研究發(fā)現(xiàn)Kr-h1基因也與蜜蜂的覓食行為有關(guān)［40］。AmKr-h1在蜜蜂的腦部大量表達(dá)。工蜂是主要覓食群體，通過熒光定量PCR檢測到工蜂體內(nèi)AmKr-h1的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于生育蜂群。研究結(jié)果表明AmKr-h1啟動子有應(yīng)答大腦中cGMP信號傳導(dǎo)的元件，AmKr-h1基因影響cGMP介導(dǎo)蛋白激酶 G(Protein Kinase G，PKG)的激活［42］。有意思的是，Duportets等的研究發(fā)現(xiàn)AiKr-h1可能與雄性球菜夜蛾的性行為成熟有關(guān)［26］。

2.3 Kr-h1基因的調(diào)控

2.3.1 JH或JH類似物(JHA)對Kr-h1表達(dá)的影響

近年來國內(nèi)外研究者們紛紛表明JH可能通過JH受體基因Met及其下游基因Kr-h1發(fā)揮其維持幼蟲形態(tài)或抑制變態(tài)的作用［31，39，42-45］。用 JH 及 JHA處理家蠶幼蟲，并通過qPCR檢測不同齡期幼蟲體內(nèi)BmKr-h1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)JH或JHA濃度增加，將引起家蠶幼蟲額外蛻皮而形成超齡幼蟲;若人為降低保幼激素含量，則會導(dǎo)致幼蟲提前化蛹，即“小”蛹。此外關(guān)于果蠅和赤擬谷盜JH信號通路的研究中，證實Kr-h1是一種重要的JH信號傳遞介質(zhì)，并且隨著JH的變化而影響轉(zhuǎn)錄水平［45-46］。

用JHA和對照組丙酮(Acetone)處理家蠶幼蟲V3(5齡后3d的幼蟲)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Kr-h1的表達(dá)量在JHA處理后的V3體內(nèi)與V0時期一樣高，而在丙酮處理后的V3體內(nèi)表達(dá)量非常低，說明在JH存在的條件下家蠶Kr-h1基因仍能正常表達(dá)而不受齡期的影響［34］。用吡丙醚(Pyriproxifen)處理西花薊馬和捕食性薊馬(Haplothrips brevitubus)，結(jié)果表明吡丙醚可以誘導(dǎo) Kr-h1的表達(dá)［31］。

因此，JH及JHA可以誘導(dǎo)Kr-h1基因表達(dá)，Krh1接收由JH受體Met傳遞的JH信號，調(diào)控其自身的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

3.3.2 Kr-h1上游調(diào)控元件

先前已經(jīng)在云杉卷葉蛾(Choristoneura fumiferana)保幼激素酯酶(JH esterase)的啟動子(Promoter)區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個30 bp的保幼激素反應(yīng)元件(CfJHRE)［47］。Kayukawa等對家蠶 Kr-h1基因的調(diào)控作了較深入的研究，發(fā)現(xiàn)在BmKr-h1上游2 kb附近有一個大小為141 bp的保幼激素應(yīng)答元件kJHRE，該元件包含有一段CACGTG序列，稱之為E-box。bHLH-PAS家族轉(zhuǎn)錄因子BmMet2接受JH信號并與另一個bHLH-PAS家族轉(zhuǎn)錄因子BmSRC2作用形成二聚體(JH/BmMet2/BmSRC2)，從而 JH/BmMet2/BmSRC2定位在 kJHRE元件上，并激活BmKr-h1［46］。值得一提的是，結(jié)合已發(fā)表資料參考文獻(xiàn)［46］，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，在果蠅、赤擬谷盜、蜜蜂、麗蠅蛹集金小蜂、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)以及褐飛虱Kr-h1基因的上游均含有E-box(圖3)。其中目前研究發(fā)現(xiàn)TcKr-h1和AmKr-h1的E-box距離Kr-h1 啟動子比較近，而 BmKr-h1、ApKr-h1、DmKr-h1、NvKr-h1和NlKr-h1的E-box距離啟動子相對較遠(yuǎn)。

3 Kr-h1與Broad complex(BrC)的互作關(guān)系

3.1 JH和Ecd的互作

圖3 Kr-h1基因的部分上游調(diào)控序列Fig.3 Partial sequence of Kr-h1 upstream region

JH和Ecd是調(diào)控昆蟲發(fā)育和變態(tài)的兩種最為重要的激素［48-49］，兩者之間相互作用、相互影響。Wang等人采用蛻皮激素和保幼激素類似物處理三眠蠶，結(jié)果用保幼激素類似物處理后的三眠蠶比正常的大，成為超齡幼蟲，而蛻皮激素處理后的三眠蠶提前蛻皮，繼而因不完全蛻皮致死［48］。有研究發(fā)現(xiàn)果蠅與家蠶和赤擬谷盜不同，外源保幼激素處理不能誘導(dǎo)幼蟲額外蛻皮形成超齡幼蟲，但持續(xù)給幼蟲喂食高濃度的保幼激素將導(dǎo)致預(yù)成蟲腹部發(fā)育異常［50］。JH可以通過調(diào)控或者抑制Ecd來影響昆蟲的變態(tài)發(fā)育過程［51］，所以說JH和Ecd是在昆蟲生長發(fā)育和成蟲發(fā)育時期的兩種重要信號傳遞者，調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育、蛻皮及成蟲的成熟。

3.2 Kr-h1與Br的互作

Br(BrC)是蛻皮激素的轉(zhuǎn)錄因子基因，通過蛻皮激素受體復(fù)合物傳遞蛻皮信號至Br，引起該基因大量轉(zhuǎn)錄并促使幼蟲蛻皮或變態(tài)。Br在蛻皮激素信號傳導(dǎo)途徑中扮演著重要的角色，也是連接保幼激素與蛻皮激素信號通路的節(jié)點。

在果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)JH通過Met和Gce傳遞信號，促使DmKr-h1基因表達(dá)上調(diào)，而DmKr-h1卻抑制 DmBr的表達(dá)［16］。家蠶的 BmKr-h1可以延遲Bombyx mori Br(BmBr)基因的表達(dá)，BmKr-h1對BmBr有抑制作用［31，52］。用吡丙醚處理西花薊馬和捕食性薊馬，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡丙醚可以誘導(dǎo)FoKr-h1的表達(dá)，而FoKr-h1抑制Frankliniella occidentalis Br(FoBr)的表達(dá)。FoKr-h1在胚胎、幼蟲及前蛹期均有不同程度的表達(dá)，直到蛹期才停止表達(dá)，而與此同時FoBr則進(jìn)行大量轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。遺憾的是，在薊馬中缺乏RNAi技術(shù)而未能進(jìn)一步明確FoKr-h1和FoBr的功能［31］。

研究還發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜Kr-h1和Br也有類似的相互作用機(jī)制［45，53］。TcKr-h1 在蛹期前均有表達(dá)，而蛹期后未見表達(dá)。通過RNA干擾等研究發(fā)現(xiàn)TcKr-h1是Tribolium castaneum Met(TcMet)下游基因，在蛹期TcMet的調(diào)控并由TcMet傳遞保幼激素信號，促使幼蟲維持形態(tài)。有意思的是，在保幼激素類似物Methoprene處理后，TcKr-h1與 Tribolium castaneum Br(TcBr)表達(dá)量出現(xiàn)了相反的趨勢，表現(xiàn)出TcKr-h1對TcBr基因的抑制作用。TcKr-h1是作為JH應(yīng)答基因，在JH信號傳達(dá)途徑中聯(lián)系TcMet，并且對蛻皮激素信號傳導(dǎo)途徑中TcBr基因有抑制作用，因此TcKr-h1和TcBr可能是聯(lián)系保幼激素和蛻皮激素兩大信號通路的關(guān)鍵基因。

雖然在家蠶、黑腹果蠅及赤擬谷盜中Kr-h1對Br均有抑制作用(圖4)，但是這種說法尚待進(jìn)一步研究明確，因此Kr-h1與Br在保幼激素和蛻皮激素信號傳導(dǎo)中的分子作用機(jī)制待進(jìn)一步研究［50］。

圖4 Kr-h1(JH信號)和Br(Ecd信號)的互作關(guān)系Fig.4 Interaction between Kr-h1(JH signaling)and Br(Ecd signaling).

4 結(jié)論與展望

綜上所述，通過多方面、多角度地挖掘JH及其相關(guān)的分子研究:JH應(yīng)答基因(反應(yīng)元件)、JH受體鑒定及其相關(guān)蛋白研究、JH與Ecd的交互作用等，逐步了解轉(zhuǎn)錄因子Kr-h1的特性與功能。目前已經(jīng)證實了JH是通過JH受體基因Met調(diào)控下游基因Kr-h1，并引起相應(yīng)的生理學(xué)反應(yīng)，當(dāng)然在JH的這一信號通路中還涉及諸多蛋白或轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)助。JH-Met-Kr-h1的調(diào)控模式是一個比較復(fù)雜的過程但是至少現(xiàn)在比較肯定的是Kr-h1可以傳遞保幼激素信號并調(diào)控昆蟲早期生長發(fā)育和變態(tài)。

總言之，Kr-h1的研究還有不少問題亟需回答。例如Kr-h1與Br如何搭建橋梁，連接JH和Ecd信號傳導(dǎo)途徑?上游保幼激素反應(yīng)元件核心區(qū)域E-box與啟動子的距離，與Kr-h1的功能是否有關(guān)?有什么樣的關(guān)聯(lián)?Kr-h1和哪些相關(guān)基因形成緊密聯(lián)系的級聯(lián)反應(yīng)?對Kr-h1的深入研究必將有助于我們更加清晰的了解JH作用的分子機(jī)制，相信在不遠(yuǎn)的將來可以研制出更為安全的生物農(nóng)藥，維護(hù)生態(tài)環(huán)境安全，同時也有助于解決農(nóng)業(yè)害蟲危害造成的大量糧食損失問題。

［1］Hang Z J，Li Q R，Zhong Y J，Cao Y.Hormone adjustment of insect development by metamorphosis.Guangdong Sericulture，2004，38(2):42-45.

［2］Hiruma K， Kaneko Y. Hormonal regulation of insect metamorphosis with special reference to juvenile hormone biosynthesis.Current Topics in Developmental Biology，2013，103:73-100.

［3］Shelby J A，Madewell R，Moczek A P.Juvenile hormone mediates sexual dimorphism in horned beetles.Journal of Experimental Zoology Part B:Molecular and Developmental Evolution，2007，308(4):417-427.

［4］Riddiford L M，Truman J W，Mirth C K，Shen Y C.A role for juvenile hormone in the prepupal development of Drosophila melanogaster.Development，2010，137(7):1117-1126.

［5］Dai H G，Wu X Y，Wu S W.The change of juvenile hormone titer and its relation with wingdimorphism of brown planthopper，Nilaparvata lugens.Acta Entomologica Sinica，2001，44(1):27-32.

［6］Daimo T，Kozaki T，Niwa R，Kobayashi I，F(xiàn)uruta K，Namiki T，Uchino K，Banno Y，Katsuma S，Tamura T，Mita K，Sezutsu H，Nakayama M，Itoyama K，Shimada T，Shinoda T.Precocious metamorphosis in the juvenile hormone-deficient mutant of the silkworm，Bombyx mori.PLoS Genetics，2012，8(3):e1002486.

［7］Zhou S T，Guo W，Song J C.Molecular mechanisms of juvenile hormone action.Chinese Journal of Applied Entomology，2012，49(5):1087-1094.

［8］Judith H W.Regulating genes for metamophosis:concepts and results//Proceedings of the International Symposium on Molecular Insect Science.New York:Plenum Press，1990:91-98.

［9］Bajgar A，Jindra M，Dolezel D.Autonomous regulation of the insect gut by circadian genes acting downstream of juvenile hormone signaling.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110(11):4416-4421.

［10］Wilson T G，F(xiàn)abian J.A Drosophila melanogaster mutant resistant to a chemical analog of juvenile hormone.Developmental Biology，1986，118(1):190-201.

［11］Shin S W，Zou Z，Saha T T，Raikhel A S.bHLH-PAS heterodimer of methoprene-tolerant and Cycle mediates circadian expression of juvenile hormone-induced mosquito genes.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109(41):16576-16581.

［12］Li M，Mead E A，Zhu J S.Heterodimer of two bHLH-PAS proteins mediates juvenile hormone-induced gene expression.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(2):638-643.

［13］Charles J P，Iwema T，Epa V C，Takaki K，Rynes J，Jindra M.Ligand-binding properties ofa juvenile hormone receptor，Methoprene-tolerant.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(52):21128-21133.

［14］Miura K，Oda M，Makita S，Chinzei Y.Characterization of the Drosophila Methoprene-tolerantgeneproduct.FEBS Journal，2005，272(5):1169-1178.

［15］Pursley S，Ashok M，Wilson T G.Intracellular localization and tissue specificity of the Methoprene-tolerant(Met)gene product in Drosophila melanogaster.InsectBiochemistry and Molecular Biology，2000，30(8/9):839-845.

［16］Abdou M A，He Q Y，Wen D，Zyaan O，Wang J，Xu J J，Baumann A A，Joseph J，Wilson T G，Li S，Wang J.Drosophila Met and Gce are partially redundant in transducing juvenile hormone action.Insect Biochemisty and Molecular Biology，2011，41(12):938-945.

［17］Baumann A，F(xiàn)ujiwara Y，Wilson T G.Evolutionary divergence of the paralogs Methoprene tolerant(Met)and germ cell expressed(gce)within the genus Drosophila.Journal of Insect Physiology，2010，56(10):1445-1455.

［18］Godlewski J，Wang S L，Wilson T G.Interaction of bHLH-PAS proteins involved in juvenile hormone reception in Drosophila.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，342(4):1305-1311.

［19］Bernardo T J，Dubrovsky E B.The Drosophila juvenile hormone receptor candidates methoprene-tolerant(MET)and germ cellexpressed(GCE)utilize a conserved LIXXL motif to bind the FTZ-F1 nuclear receptor.Journal of Biological Chemistry，2012，287(10):7821-7833.

［20］Abdou M，Peng C，Huang J H，Zyaan O，Wang S，Li S，Wang J.Wnt signaling cross-talks with JH signaling by suppressing Met and gce expression.PLoS One，2011，6(11):e26772.

［21］Lindebro M C，Poellinger L，Whitelaw M L.Protein-protein interaction via PAS domains:role of the PAS domain in positive and negative regulation of the bHLH/PAS dioxin receptor-Arnt transcription factor complex.EMBO Journal，1995，14(14):3528-3539.

［22］Travis J B，Edward B D.Molecular mechanisms of transcription activation by juvenile hormone:A critical role for bHLH-PAS and nuclear receptor proteins.Insects，2012，3(1):324-338.

［23］Jindra M，Palli S R，Riddiford L M.The juvenile hormone signaling pathway in insect development.Annual Review of Entomology，2013，58(1):181-204.

［24］Schuh R，Aicher W，Gaul U，C?te S，Preiss A，Maier D，Seifert E，Nauber U，Schuroder C，Kemler R，J?ckle H.A conserved family of nuclear proteins containing structural elements of the finger protein encoded by Krüppel，a Drosophila segmentation gene.Cell，1986，47(6):1025-1032.

［25］Huang J H，Lozano J，Belles X.Broad-complex functions in postembryonic development of the cockroach Blattella germanica shed new lighton the evolution ofinsectmetamorphosis.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects，2013，1830(1):2178-2187.

［26］Duportets L，Bozzolan F，Abrieux A，Maria A，Gadenne C，Debernard S.The transcription factor Krüppel homolog 1 is linked to the juvenile hormone-dependent maturation of sexual behavior in themale moth，Agrotisipsilon.Generaland Comparative Endocrinology，2012，176(2):158-166.

［27］Beck Y，Pecasse F，Richards G.Krüppel-homolog is essential for the coordination of regulatory gene hierarchies in early Drosophila development.Developmental Biology，2004，268(1):64-75.

［28］Minakuchi C，Zhou X F，Riddiford L M.Krüppel homolog 1(Krh1)mediates juvenile hormone action during metamorphosis of Drosophila melanogaster.Mechanisms of Development，2008，125(1/2):91-105.

［29］Pecasse F，Beck Y，Ruiz C，Richards G.Krüppel-homolog，a stage-specific modulator of the prepupal ecdysone response，is essential for Drosophila metamorphosis.Developmental Biology，2000，221(1):53-67.

［30］Minakuchi C，Namiki T，Shinoda T.Krüppel homolog 1，an early juvenile hormone-response gene downstream ofMethoprenetolerant，mediates its anti-metamorphic action in the red flour beetle Tribolium castaneum.Developmental Biology，2009，325(2):341-350.

［31］Minakuchi C，Tanaka M，Miura K，Tanaka T.Developmental profile and hormonal regulation of the transcription factors broad and Krüppelhomolog 1 in hemimetabolous thrips.Insect Biochemisty and Molecular Biology，2011，41(2):125-134.

［32］Lozano J，Belles X.Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species.Scientific Reports，2011，1:163-169.

［33］Benevolenskaya E V，F(xiàn)rolov M V，Birchler J A.Krüppel homolog(Kr-h)is a dosage-dependent modifier of gene expression in Drosophila.Genetical Research，2000，75(2):137-142.

［34］Hiroto M，Kakei M，Iwami M，Sakurai S.Hormonal regulation of the death commitment in programmed cell death of the silkworm anterior silk glands.Journal Insect Physiology，2012，58(12):1575-1581.

［35］Sheng Z T，Xu J Q，Bai H，Zhu F，Palli S R.Juvenile hormone regulates vitellogenin gene expression through insulin-like peptide signaling pathway in the red flour beetle，Tribolium castaneum.Journal of Biological Chemistry，2011，286(49):41924-41936.

［36］Belles X.Origin and evolution of insect metamorphosis//Encyclopedia of Life Sciences(ELS).Chichester:John Wiley＆Sons，Ltd.，2011.

［37］Fichelson P，Brigui A，Pichaud F.Orthodenticle and Krüppel homolog 1 regulate Drosophila photoreceptor maturation.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109(20):7893-7898.

［38］Shi L，Lin S W，Grinberg Y，Beck Y，Grozinger C M，Robinson G E，Lee T.Roles of Drosophila Krüppel-homolog 1 in neuronal morphogenesis.Developmental Neurobiology，2007，67(12):1614-1626.

［39］Feyereisen R，Jindra M.The silkworm coming of age—early.PLoS Genetics，2012，8(3):e1002591.

［40］Fussnecker B，Grozinger C.Dissecting the role of Kr-h1 brain gene expression in foraging behaviorin honeybees(Apis mellifera).Insect Molecular Biology，2008，17(5):515-522.

［41］Martins J R，Nunes F，Cristino A S，Sim?es Z，Bitondi M.The four hexamerin genes in the honey bee:structure，molecular evolution and function deduced from expression patterns in queens，workers and drones.BMC Molecular Biology，2010，11:23-42.

［42］Shpigler H，Patch H M，Cohen M，F(xiàn)an Y L，Grozinger C M，Bloch G.The transcription factor Krüppel homolog 1 is linked to hormone mediated social organization in bees.BMC Evolutionary Biology，2010，10:120-132.

［43］Zhang Z L，Xu J J，Sheng Z T，Sui Y P，Palli S R.Steroid receptor co-activator is required for juvenile hormone signal transduction through a bHLH-PAS transcription factor，methoprene tolerant.Journal of Biological Chemistry，2011，286(10):8437-8447.

［44］Jindra M，Charles J P，Iwema T，Iwema T，Epa V C，Takaki K，Konopova B，Smykal V，Rynes J.Signaling through the JH receptor Met and the repressor of metamorphosis Kr-h1 is common to insects//24th International Congress of Entomology.Daegu，2012.

［45］Parthasarathy R， Tan A J， Palli S R.bHLH-PAS family transcription factor methoprene-tolerant plays a key role in JH action in preventing the premature development of adult structures during larval-pupal metamorphosis.Mechanisms of Development，2008，125(7):601-616.

［46］Kayukawa T，Minakuchi C，Namiki T，Togawa T，Yoshiyama M，Kamimura M，Mita K，Imanishi S，Kiuchi M，Ishikawa Y，ShinodaT.Transcriptionalregulation ofjuvenile hormonemediated induction of Krüppel homolog 1，a repressor of insect metamorphosis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109(29):11729-11734.

［47］Kethidi D R，Perera S C，Zheng S，F(xiàn)eng Q L，Krell P，Retnakaran A，Palli S R.Identification and characterization of a juvenile hormone(JH)response region in the JH esterase gene from the spruce budworm，Choristoneura fumiferana.Journal of Biological Chemistry，2004，279(19):19634-19642.

［48］Wang H B，Ali S M，Moriyama M，Iwanaga M，Kawasaki H.20-hydroxyecdysone and juvenile hormone analog prevent precocious metamorphosis in recessive trimolter mutants of Bombyx mori.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2012，42(2):102-108.

［49］Zera A J.Evolutionary geneticsofjuvenile hormone and ecdysteroid regulation in Gryllus:a case study in the microevolution of endocrine regulation.Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular ＆ Integrative Physiology，2006，144(3):365-379.

［50］Zhou X，Riddiford L M.Broad specifies pupal development and mediates the‘status quo’action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca.Development，2002，129(9):2259-2269.

［51］Ye G Y，Hu C，Gong H.Effects of juvenile hormone and ecdysteroid on ovarian development of the Japanese oak silkworm Antheraea yamamai.Journal of Zhejiang Agricultural University，1999，25(3):276-280.

［52］Piulachs M D，Pagone V，Bellés X.Key roles of the Broad-Complex gene in insect embryogenesis.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2010，40(6):468-475.

［53］Suzuki Y，Truman J W，Riddiford L M.The role of Broad in the development of Tribolium castaneum:implications for the evolution of the holometabolous insect pupa.Development，2008，135(3):569-577.

參考文獻(xiàn):

［1］黃志君，李慶榮，鐘仰進(jìn)，曹陽.昆蟲變態(tài)發(fā)育的激素調(diào)控.廣東蠶業(yè)，2004，38(2):42-45.

［5］戴華國，吳曉毅，武淑文.褐飛虱體內(nèi)保幼激素滴度變化及其與翅型分化的關(guān)系.昆蟲學(xué)報，2001，44(1):27-32.

［7］周樹堂，郭偉，宋佳晟.保幼激素的分子作用機(jī)制研究.應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2012，49(5):1087-1094.

［51］葉恭銀，胡萃，龔和.保幼激素和蛻皮激素對天蠶卵巢發(fā)育的影響.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，25(3):276-280.