孫松，馬麗，劉雄民，關(guān)文龍

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧 530003)

苯乙酮廣泛應(yīng)用于皂用香精和煙草香精等香料制造以及化妝品行業(yè)中。微生物合成苯乙酮?jiǎng)t由于其生產(chǎn)過(guò)程環(huán)保，且具有良好的香氣品質(zhì)而備受關(guān)注［1-2］。測(cè)定肉桂酸或苯乙酮方法主要有極譜法、薄層掃描法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、紫外分光光度法等［3-6］。其中紫外分光光度法由于其分析時(shí)間短、操作方法簡(jiǎn)便而且分析成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而最具應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值。但是發(fā)酵液自身的一些營(yíng)養(yǎng)成分和菌體的紫外吸收有可能會(huì)干擾分析結(jié)果，目前主要通過(guò)額外配制加入底物前的發(fā)酵液作為參比溶液的方法扣除此類(lèi)干擾［7］，該方法需要額外精確配制和儲(chǔ)備特殊參比溶液，并且對(duì)發(fā)酵液在加入底物前后的紫外吸收變化情況未做相應(yīng)驗(yàn)證。且發(fā)酵液自身的紫外吸收由于在加入底物后難以直接測(cè)定。因此，針對(duì)其在轉(zhuǎn)化過(guò)程中變化情況的相關(guān)研究也鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。在由肉桂酸發(fā)酵制備苯乙酮的放大生產(chǎn)過(guò)程中，建立一種簡(jiǎn)單快速的轉(zhuǎn)化率測(cè)定方法用于轉(zhuǎn)化過(guò)程的監(jiān)控，具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

本文利用投影模擬［8］的方法進(jìn)行了肉桂酸苯乙酮相對(duì)含量的檢測(cè)，并將其做了延伸應(yīng)用，首次利用該方法驗(yàn)證了30 L發(fā)酵罐中菌株Mucor sp.發(fā)酵液自身紫外吸收在加入底物后的轉(zhuǎn)化過(guò)程中無(wú)明顯變化;并通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)化初期肉桂酸含量的測(cè)量值與真實(shí)值(100%)之間的校正系數(shù)來(lái)扣除發(fā)酵液自身的干擾，將成分復(fù)雜的轉(zhuǎn)化液檢測(cè)簡(jiǎn)化為簡(jiǎn)單的肉桂酸和苯乙酮二組分檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單有效，無(wú)需額外配制和儲(chǔ)備特殊參比溶液。且該方法的驗(yàn)證和測(cè)量用轉(zhuǎn)化液樣品取自30 L中試用發(fā)酵罐，比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中的搖瓶發(fā)酵更接近工業(yè)生產(chǎn)條件，因此，十分適用于微生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的條件優(yōu)化以及轉(zhuǎn)化率的快速檢測(cè)和過(guò)程跟蹤。另外，本文還將該方法與液相色譜法進(jìn)行了比較。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

苯乙酮、肉桂酸、無(wú)水乙醇均為分析純;實(shí)驗(yàn)菌種為本課題組篩選得到的菌種。

UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);SPD-10A UV-VIS高效液相色譜儀(LC-20AT泵);色譜柱Alltima C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

1.2 溶液配制

1.2.1 肉桂酸和苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精確稱(chēng)取相同摩爾濃度的肉桂酸和苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品(分別為0.261 8 g和0.212 2 g)，以無(wú)水乙醇溶解定容到100 mL的棕色容量瓶，分別配制成等摩爾濃度溶液Ⅰ和Ⅱ，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 轉(zhuǎn)化液的制備 將菌株 Mucor sp.接種于30 L發(fā)酵罐中，在適合的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。再加入90 g左右肉桂酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化液。

1.3 轉(zhuǎn)化液的液相色譜分析

準(zhǔn)確移取轉(zhuǎn)化液2 mL，用無(wú)水乙醇稀釋定容至10 mL。離心，取上清液進(jìn)行高效液相色譜分析。色譜條件:流動(dòng)相為乙腈 ∶水 ∶冰醋酸=65∶35∶0.05;檢測(cè)波長(zhǎng) 249 nm;流速 1.0 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉桂酸、苯乙酮及其混合物的紫外光譜特性

溶液Ⅰ和Ⅱ與肉桂酸相對(duì)摩爾含量0，20%，40%，60%，80%，100%的比例依次混合，得到6份總摩爾濃度相同的肉桂酸和苯乙酮混合溶液各10 mL。取20 μL再稀釋至10 mL后進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。曲線1和曲線6分別為100%肉桂酸和100%苯乙酮的紫外吸收。

由圖1可知，肉桂酸和苯乙酮的最大吸收波長(zhǎng)分別為272 nm和241 nm，曲線1～6交于O點(diǎn)，該點(diǎn)為兩化合物的等吸收點(diǎn)，波長(zhǎng)為249 nm，當(dāng)總摩爾濃度為3.53 ×10－5mol/L 時(shí)，吸光度為0.317 9。以標(biāo)準(zhǔn)溶液1～6在272 nm(此處吸光度差值最大，故選擇272 nm為檢測(cè)波長(zhǎng))的吸光度A272對(duì)肉桂酸相對(duì)摩爾含量X進(jìn)行線性回歸，可得肉桂酸相對(duì)摩爾含量的回歸方程:

由于式(1)是在標(biāo)準(zhǔn)溶液等吸收點(diǎn)處的吸光度為0.317 9時(shí)得出，而待測(cè)樣品的吸收曲線①不滿足該方程的使用條件，因此需將樣品稀釋?zhuān)梦涨€②，再利用等比例關(guān)系，模擬［8］出樣品在等吸收點(diǎn)處吸光度為0.317 9的吸收曲線③，吸收曲線③符合式(1)使用條件，此時(shí)利用式(1)即可求出肉桂酸相對(duì)摩爾含量。另由于發(fā)酵液自身存在紫外吸收，故式(1)不直接適用于轉(zhuǎn)化液中肉桂酸相對(duì)摩爾含量的測(cè)定，需扣除發(fā)酵液自身吸收干擾。

圖1 總摩爾濃度相同但相對(duì)摩爾含量不同的肉桂酸和苯乙酮混合物的紫外光譜Fig.1 UV spectrum of mixture of CMA and APO with the same molar fraction but different total molar concentration

2.2 轉(zhuǎn)化液定量分析方程的建立

2.2.1 發(fā)酵液自身紫外吸收變化驗(yàn)證 于30 L發(fā)酵罐中分別移取適量轉(zhuǎn)化前(6 h)、中(72 h)、后期(96 h)轉(zhuǎn)化液，稀釋到適合濃度后測(cè)量其紫外吸收曲線，利用2.1節(jié)的方法模擬至同等吸收點(diǎn)后得到轉(zhuǎn)化前、中、后期吸收曲線1，2，3。再利用等比例關(guān)系，將曲線1，2投影模擬出曲線3'，見(jiàn)圖2。

圖2 由轉(zhuǎn)化前期曲線1與中期曲線2通過(guò)比例關(guān)系投影出的曲線3＇與后期實(shí)際吸收曲線3Fig.2 UV spectrum of fermentation broth in initial，middle and late stage(spectrum 1，2，3)and theoretical spectrum 3＇

由圖2可知，模擬出的吸收曲線3與實(shí)際吸收曲線3相吻合，表明發(fā)酵液的自身吸收在轉(zhuǎn)化的過(guò)程中無(wú)明顯變化，否則會(huì)由于受到發(fā)酵液自身吸收變化的影響，由前、中期投影模擬出的后期吸收曲線會(huì)與實(shí)際后期吸收曲線存在較大偏移。因此，該菌株發(fā)酵液自身紫外吸收在整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中變化可忽略。

2.2.2 發(fā)酵液自身吸收干擾的扣除及總分析方程的建立 由于菌株Mucor sp.發(fā)酵液在轉(zhuǎn)化過(guò)程中其發(fā)酵液的背景吸收曲線無(wú)明顯變化，則可認(rèn)為其在波長(zhǎng)為272 nm處吸光度A0保持不變。式(1)可以變?yōu)?

其中，A0/0.697 5在整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中不變，即為校正系數(shù)，在轉(zhuǎn)化初期(＜6 h)酶處于誘導(dǎo)時(shí)期時(shí)取樣，此時(shí)肉桂酸未轉(zhuǎn)化，含量為100%，校正系數(shù)可用下式求出:

聯(lián)立式(2)、(3)，得出轉(zhuǎn)化液定量分析方程:

其中，A總與 A總(初期)均為轉(zhuǎn)化液經(jīng)稀釋模擬回歸至等吸收點(diǎn)為0.317 9時(shí)272 nm處的吸光度。

2.3 生物轉(zhuǎn)化液中肉桂酸和苯乙酮相對(duì)摩爾含量(轉(zhuǎn)化率)的測(cè)定

于轉(zhuǎn)化初期取樣，用無(wú)水乙醇稀釋至合適濃度后測(cè)量其249 nm與272 nm處吸光度A272(樣品)(初期)與 A249(樣品)(初期)，再通過(guò)稀釋?zhuān)瑴y(cè)得其稀釋液吸光度 A272(稀釋)(初期)和 A249(稀釋)(初期)，通過(guò)式(5)計(jì)算出 A總(初期)。

相同方法取樣，測(cè)試計(jì)算任意轉(zhuǎn)化時(shí)間吸光度A總，最后利用式(4)即可得出該轉(zhuǎn)化時(shí)刻肉桂酸相對(duì)摩爾含量X肉桂酸，苯乙酮相對(duì)摩爾含量(即轉(zhuǎn)化率)為100% －X肉桂酸。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

配制適宜質(zhì)量濃度的肉桂酸和苯乙酮的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液25 mL，平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 方法的精密度Table 1 Precision of analysis method

由表1可知，兩者的重復(fù)性都較高，標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為 1.02%和 1.45%。

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制適宜質(zhì)量濃度的肉桂酸和苯乙酮的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液25 mL，室溫下放置，在24 h內(nèi)測(cè)定溶液肉桂酸和苯乙酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，在24 h內(nèi)兩者均比較穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.94%和4.07%。

表2 方法的穩(wěn)定性Table 2 Stability of analysis method

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取3份相同已知濃度的樣品，分別添加低、中、高濃度的肉桂酸和苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別測(cè)定加標(biāo)樣品中肉桂酸和苯乙酮的濃度(等吸收點(diǎn)測(cè)總濃度，式(1)測(cè)含量)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，肉桂酸和苯乙酮的平均回收率分別為101.34%和99.94%，標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.53%和 0.46%。

表3 方法的回收率Table 3 Recovery of analysis method

2.7 生物轉(zhuǎn)化樣品的測(cè)定

將1份轉(zhuǎn)化液樣品稀釋到合適濃度后，使用上述UV法和HPLC分別測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品的測(cè)定與t值檢驗(yàn)Table 4 Determination of sample and t value test

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)的t檢驗(yàn)，所得t值為1.92，小于結(jié)果的臨界值2.92(α=0.05)，表明這兩種方法無(wú)顯著性差異，說(shuō)明所建立的分析方法準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

針對(duì)微生物轉(zhuǎn)化液的紫外檢測(cè)時(shí)不可避免的發(fā)酵液自身的紫外吸收干擾問(wèn)題，開(kāi)展了生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的復(fù)雜體系定量分析方法研究，得到了如下結(jié)論:

(1)投影模擬法證明發(fā)酵液在轉(zhuǎn)化期間其自身吸收無(wú)明顯變化后，通過(guò)初期取樣可獲得校正系數(shù)，可通過(guò)該校正系數(shù)扣除發(fā)酵液自身干擾。

(2)肉桂酸相對(duì)含量與吸光度關(guān)系為:X肉桂酸=100% － (A總(初)－ A總)/0.697 5，苯乙酮相對(duì)含量(即轉(zhuǎn)化率)與吸光度關(guān)系為:X苯乙酮=(A總(初)－A總)/0.697 5。A總與 A總(初期)均為轉(zhuǎn)化液經(jīng)稀釋模擬回歸至等吸收點(diǎn)為0.317 9時(shí)272 nm處的吸光度。

(3)用t檢驗(yàn)法將新建UV法與HPLC法進(jìn)行判斷，兩種方法無(wú)顯著性差異。

(4)該方法的驗(yàn)證與檢測(cè)所用轉(zhuǎn)化液樣品取自30 L中試用發(fā)酵罐，更接近工業(yè)生產(chǎn)條件。因此，該方法十分適用于微生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中的條件優(yōu)化以及轉(zhuǎn)化率的快速檢測(cè)和過(guò)程跟蹤。

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