李秋，李貴榮，劉長(zhǎng)鶴，韓倩

(南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南衡陽(yáng) 421001)

孔雀石綠(MG)和結(jié)晶紫(CV)同屬于堿性三苯甲烷類染料，具有類似結(jié)構(gòu)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、保鮮和運(yùn)輸過(guò)程中，作為殺菌劑和抗寄生蟲(chóng)藥，用于魚(yú)類水霉病、爛鰓病、寄生蟲(chóng)的防治及原生動(dòng)物感染等［1-2］。由于孔雀石綠和結(jié)晶紫對(duì)人畜具有潛在的致畸、致癌和致突變作用［3-4］，20世紀(jì)90年代以來(lái)世界各國(guó)陸續(xù)將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖的禁用藥物。但由于孔雀石綠和結(jié)晶紫價(jià)格低廉，而且抗菌效果較好，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍被部分養(yǎng)殖戶使用，現(xiàn)已成為影響食品安全的熱點(diǎn)問(wèn)題。

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)孔雀石綠和結(jié)晶紫及其殘留的方法主要有:液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜法［5］、分子印跡固相萃取高效液相色譜法［6］、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［7］。上述方法所需儀器昂貴，操作條件嚴(yán)格，樣品處理復(fù)雜，應(yīng)用受到限制。

本文將濁點(diǎn)萃取和比值導(dǎo)數(shù)兩種技術(shù)相結(jié)合，建立一種新的濁點(diǎn)萃取-比值導(dǎo)數(shù)光度法，用于不經(jīng)分離同時(shí)測(cè)定水樣中孔雀石綠和結(jié)晶紫。方法無(wú)需昂貴儀器，操作方便，樣品處理簡(jiǎn)單，易于普及應(yīng)用，測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

孔雀石綠、結(jié)晶紫、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀等試劑均為分析純;TritonX-114純度為100%;實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);PB-21酸度計(jì);AB204-S電子分析天平;SHHW.21-電熱恒溫三用水箱;TD5K-Ⅲ低速離心機(jī)。

1.2 比值導(dǎo)數(shù)光度法原理

若a和b二組分混合溶液，在某波長(zhǎng)區(qū)吸光度具有加和性，即:

對(duì)式(2)求微分，得導(dǎo)數(shù)比值光譜。

式(4)可作為組分a定量分析依據(jù)。同理，可推導(dǎo)b組分的定量分析依據(jù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 濁點(diǎn)萃取 在10 mL的離心管中依次加入pH 2.8鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液1.5 mL，一定量孔雀石綠(或結(jié)晶紫)標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度5%的TritonX-114溶液1.2 mL，用蒸餾水定容至10 mL刻度線，搖勻，放入50℃恒溫水浴箱中15 min，溶液變渾濁，取出。以4 000 r/min離心5 min，上層水相棄去。加入無(wú)水乙醇，溶解底層孔雀石綠(或結(jié)晶紫)富集相并稀釋到0.5 mL。

1.3.2 比值導(dǎo)數(shù)光譜 將上述溶液轉(zhuǎn)入微型吸收池中，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定400～700 nm波長(zhǎng)范圍吸收光譜，并應(yīng)用數(shù)據(jù)處理軟件處理，得到比值吸收光譜和導(dǎo)數(shù)比值吸收光譜。選擇639，476 nm波長(zhǎng)分別為孔雀石綠和結(jié)晶紫的測(cè)定波長(zhǎng)，以該兩波長(zhǎng)處的導(dǎo)數(shù)比值光譜吸收值分別對(duì)孔雀石綠和結(jié)晶紫濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定樣品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜

圖1是在表面活性劑富集相中孔雀石綠和/或結(jié)晶紫的吸收光譜圖。

圖1 吸收光譜Fig.1 The absorption spectra

由圖1可知，孔雀石綠吸收峰位于624 nm處 ，結(jié)晶紫吸收峰位于593 nm處，二者的吸收光譜存在嚴(yán)重的相互重疊。應(yīng)用比值導(dǎo)數(shù)法可以消除兩者之間的干擾，則可在兩者物質(zhì)共存的情況下，對(duì)兩者直接進(jìn)行測(cè)定。

2.2 比值吸收光譜和比值導(dǎo)數(shù)光譜及測(cè)量波長(zhǎng)的選擇

按照比值導(dǎo)數(shù)光譜的原理，以濃度為8.0×10－6mol/L CV溶液的吸收光譜為除數(shù)因子，對(duì)二者混合溶液的吸收光譜進(jìn)行比值-微分處理(以消除共存結(jié)晶紫的干擾)，得到孔雀石綠的比值光譜和比值一階導(dǎo)數(shù)光譜，見(jiàn)圖2。

圖2 孔雀石綠的比值光譜(a)和比值一階導(dǎo)數(shù)光譜(b)Fig.2 The ratio spectra(a)and first derivative ratio spectra(b)of MG(1～8MG:0.1～10×10－6mol/L)

由圖2可知，該比值導(dǎo)數(shù)光譜中440，639 nm波長(zhǎng)處的導(dǎo)數(shù)值均與孔雀石綠的濃度成比例。根據(jù)加標(biāo)回收率等相關(guān)指標(biāo)，選擇639 nm作為孔雀石綠的測(cè)量波長(zhǎng)。

以濃度為6.0×10－6mol/L MG溶液的吸收光譜為除數(shù)因子，求得結(jié)晶紫的比值光譜和一階比值導(dǎo)數(shù)光譜，見(jiàn)圖3。同理，根據(jù)圖3可選擇476 nm作為結(jié)晶紫的測(cè)量波長(zhǎng)。

圖3 結(jié)晶紫的比值光譜(a)和比值一階導(dǎo)數(shù)光譜(b)Fig.3 The ratio spectra(a)and first derivative ratio spectra(b)of CV(1～8CV:0.1～10×10－6mol/L)

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 緩沖溶液及pH值的選擇 實(shí)驗(yàn)了檸檬酸鈉-鹽酸、檸檬酸鈉-檸檬酸、鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、甘氨酸-鹽酸、B-R緩沖液對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果表明，鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸溶液的萃取效率最高。因此，選擇了鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸作為該體系的緩沖液。pH值對(duì)體系萃取效率的影響，見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)體系(孔雀石綠和結(jié)晶紫)吸收值的影響Fig.4 The effect of pH value of the system(MG+CV)

由圖4可知，當(dāng)pH＜2.8時(shí)，隨著pH值增大，孔雀石綠和結(jié)晶紫的吸收值增大，當(dāng)pH＞2.8后，吸收值反而減小。因此，選擇pH為2.8。

鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖溶液pH為2.8，考察緩沖溶液用量對(duì)濁點(diǎn)萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 緩沖液用量對(duì)MG和CV混合物體系吸光度的影響Fig.5 The effect of buffer solutions volumes on the system(MG+CV)

由圖5可知，緩沖溶液用量在1.5 mL時(shí)，吸光度值較高。所以，選擇緩沖溶液用量為1.5 mL。

2.3.2 表面活性劑及用量的選擇 采用TritonX-114、TritonX-100和吐溫-80三種表面活性劑，結(jié)果表明，TritonX-114的萃取效率最高。如圖6顯示，對(duì)孔雀石綠和結(jié)晶紫的混合溶液萃取后測(cè)定，TritonX-114的用量為1.2 mL時(shí)，吸收值達(dá)到了最大值。說(shuō)明萃取率最好，故選擇TritonX-114的用量為1.2 mL。

圖6 TritonX-114用量對(duì)孔雀石綠和結(jié)晶紫混合溶液吸光度的影響Fig.6 The effect of TritonX-114 solutions volumes on the system(MG+CV)

2.3.3 萃取溫度和平衡時(shí)間的選擇 考察了水浴溫度30～75℃ 和平衡時(shí)間5～40 min對(duì)體系吸光度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，水浴溫度為50℃ 時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，說(shuō)明萃取效率最好。隨著萃取平衡時(shí)間的增長(zhǎng)，富膠束相萃取率越高吸光度越大，15 min即可萃取完全。故本萃取實(shí)驗(yàn)選擇溫度為50℃，水浴中加熱15 min。

2.4 方法的檢出限和線性范圍

2.4.1 除數(shù)因子的選擇 實(shí)驗(yàn)選擇了不同濃度的孔雀石綠或結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液作為除數(shù)因子，比較所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍、斜率和相關(guān)系數(shù)，并選擇最佳的結(jié)果，以提高測(cè)定的準(zhǔn)確度和靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用濃度為8.0×10－6mol/L的MG和6.0×10－6mol/L的CV作為除數(shù)因子時(shí)，分析方法的相關(guān)指標(biāo)較好。

2.4.2 方法的檢出限和線性范圍 在優(yōu)化的條件下，取不同量的孔雀石綠和/或結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法的步驟，求得回歸方程分別為:

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，孔雀石綠和結(jié)晶紫在1.0×10－8～1.0×10－6mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限分別為 3.93 ×10－9，4.96 ×10－9mol/L。在線性范圍內(nèi)，配制高中低3組濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)，孔雀石綠的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 4.08%，3.89%，1.22%，結(jié)晶紫的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 4.31%，3.85%，3.39%。

由于濁點(diǎn)萃取前總體積為10 mL，預(yù)富集后總體積為0.5 mL，所以富集倍率為20倍。

2.5 共存離子的干擾實(shí)驗(yàn)

以孔雀石綠和結(jié)晶紫的混合溶液(MG和CV濃度均為4.0×10－7mol/L)進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，考察了常見(jiàn)離子及有機(jī)物對(duì)測(cè)定的影響。當(dāng)相對(duì)誤差控制小于±5% 時(shí)(以倍計(jì))，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 常見(jiàn)離子及有機(jī)物的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Interfere with test result of common ions and organics

2.6 樣品的處理和測(cè)定

池塘水經(jīng)離心分離后，取上清液，在最佳條件下測(cè)定，重復(fù)5次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 水樣測(cè)定結(jié)果(n=5)Table 2 The determination results of water samples

由表2可知，孔雀石綠和結(jié)晶紫在樣品中加標(biāo)回收率分別為 96.6% ～104.0% 和 98.5% ～110.0%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合濁點(diǎn)萃取和比值導(dǎo)數(shù)兩種技術(shù)，建立了一種濁點(diǎn)萃取-比值導(dǎo)數(shù)分光光度新方法，實(shí)現(xiàn)了不經(jīng)分離同時(shí)檢測(cè)環(huán)境水樣中的孔雀石綠和結(jié)晶紫含量的一種。該方法簡(jiǎn)單、安全、無(wú)污染、靈敏度高，用于測(cè)定實(shí)際樣品，結(jié)果令人滿意。

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