李慧芳

(煙臺大學(xué)文經(jīng)學(xué)院，山東煙臺 264005)

有機氯農(nóng)藥(OCPs)是一類由碳?xì)渎葮?gòu)成的有機化合物(有的種類含硫元素)，具有顯著的殺蟲效果，并對惡性傳染病的控制、農(nóng)林病害的防治等起著非常重要的作用。但由于OCPs為持久性污染物，難于降解，能通過食物鏈富集于生物體內(nèi)，故可威脅到食品安全。魚肉作為人類膳食中蛋白質(zhì)的重要來源，控制其中的OCPs殘留水平對人體健康至關(guān)重要。目前，魚肉中OCPs殘留分析的樣品前處理方法主要包括固相萃?。?］、固相微萃取［2］、基質(zhì)固相分散技術(shù)［3］、凝膠滲透色譜法［4］、微波消解法［5］等。但是通過實踐發(fā)現(xiàn)，上述方法存在操作繁瑣、耗時、成本高、勞動強度大、試劑用量大、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，而且提取凈化能力不強。

雙水相萃取技術(shù)是近年來出現(xiàn)的引人注目、極有前途的新型分離技術(shù)，利用物質(zhì)在互不相溶的兩水相間分配系數(shù)的差異來進行萃取。該技術(shù)已被廣泛用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域，可對細(xì)胞、膜、病毒、蛋白質(zhì)、核酸以及其他天然藥物有效成分進行分離和提純［6-15］。然而，傳統(tǒng)以高聚物-高聚物或高聚物-鹽所形成的雙水相體系，由于粘度太大，會干擾萃取結(jié)果，而且成本過高，經(jīng)濟上不具優(yōu)勢。所以，需要開發(fā)新型的雙水相體系，這也成為雙水相萃取研究的熱點。

研究表明，無機鹽、水與乙腈［16-19］、異丙醇［10-20］、丙酮和乙醇［20］等水溶性有機溶劑以適當(dāng)比例混合時，也能分成兩相。這種新型的雙水相體系具有操作簡單、對分析物無干擾，試劑低毒、低粘度，傳質(zhì)和分相速度快等優(yōu)點，并已成功的應(yīng)用于多種金屬離子的萃取分析［21-25］。因此，利用OCPs在這種新型雙水相體系中具有較大的分配系數(shù)，來實現(xiàn)魚肉中有機氯農(nóng)藥殘留的高效提取具有重要意義，而目前還未見有這方面的報道。本研究旨在利用乙腈-無機鹽-水雙水相體系來提取凈化魚肉中的OCPs殘留，建立魚肉中OCPs殘留分析的樣品前處理新方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

α-BHC、β-BHC、δ-BHC、o，p-DDE、p，p-DDE、o，p-DDD、p，p-DDD、o，p-DDT、p，p-DDT 等 9 種 OCPs均購自 Dr.Ehrenstorfer GmbH，純度在 97.0% ～99.0%;cleanert C18和 PSA(20 ～40 μm);所有溶劑均為色譜級。

島津GC2010氣相色譜儀(配有ECD檢測器);OL-861漩渦振蕩器;Hitachi 20PR-520制冷高速離心機;UPWS-超純水系統(tǒng)。

1.2 色譜分析條件

色譜柱為DB-1毛細(xì)管柱;載氣為氮氣，流速1.0 mL/min;進樣口溫度 200℃;檢測器溫度320℃;進樣量1 μL，進樣方式為分流進樣，分流比15∶1;初始溫度 150 ℃，保持 2 min，6 ℃/min→270℃，保持8 min。

1.3 試液的配制

9種有機氯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別稱取1 mg于10 mL容量瓶中，正己烷定容，作為混標(biāo)儲備液，于－20℃保存?zhèn)溆?。然后配制濃度?100，50，20，10 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 雙水相體系的制備

10 mL比色管中加入適量無機鹽、5 mL水和適量乙腈，然后加入9種OCPs混標(biāo)，漩渦1～2 min，室溫下靜置，待溶液分層后，氣相色譜進樣檢測。然后計算體系的相比、富集因子以及OCPs的萃取率。

1.5 魚肉樣品前處理

稱取已勻漿的鯉魚脊背肉2.5 g，依次加入5 mL水和4 mL乙腈，漩渦1 min后加入2.0 g醋酸鉀，漩渦1 min，然后3 500 r/min離心10 min。將上相清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，分別加入1 g無水硫酸鎂和 0.1 g PSA固體顆粒，漩渦 1 min后3 500 r/min離心10 min，取上清液，氣相色譜進樣檢測。

1.6 國標(biāo)方法測定魚肉中OCPs農(nóng)藥殘留

參考國標(biāo)方法［4］，對魚肉中9種OCPs殘留進行了檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系的制備

2.1.1 無機鹽的選擇 雙水相是由親水性有機溶劑、無機鹽、水組成的兩相體系，我們選取了鉀鹽、鈉鹽、銨鹽作為研究對象，根據(jù)文獻報道［16-19］，這幾類常見的無機鹽與水、乙腈形成雙水相時，分相能力大小順序為:KC2H3O2＞ K2CO3＞KF＞KBr;(NH4)2SO4＞Na2CO3＞Na3C6H5O7＞Na2S2O3＞Na2SO4，據(jù) 此 首 先 篩 選 了 KC2H3O2、K2HPO4、K2CO3、Na2CO3、NaC2H3O2和(NH4)2SO4這 6 種無機鹽。但是通過實際操作發(fā)現(xiàn)，六六六在K2CO3和Na2CO3與水、乙腈形成的雙水相中會發(fā)生降解，故這兩種體系不適于分析OCPs殘留。實驗最終選擇KC2H3O2、K2HPO4、NaC2H3O2和(NH4)2SO4這 4 種鹽分別與乙腈、水形成雙水相。

2.1.2 無機鹽含量對相平衡產(chǎn)生的影響 我們分別研究了4種雙水相體系中無機鹽含量對富集因子(F=V水/V上相)和相比(R=V上相/V下相)的影響。

圖1 鹽含量對富集因子的影響Fig.1 Effect of the amount of salt on enrichment factor

由圖1可知，固定體系中加入5.0 mL水和2 mL乙 腈，當(dāng) NaC2H3O2、(NH4)2SO4、K2HPO4和KC2H3O2四種鹽含量分別為 2.0 ～2.5 g，1.0 ～2.3 g，1.3 ～2.0 g和2.0 ～3.0 g時，富集因子 F 分別穩(wěn)定在9，3，3和5左右。

圖2 鹽含量對相比的影響Fig.2 Effect of the amount of salt on the phase-volume ratio

由圖2可知，當(dāng)體系中水和乙腈體積保持不變時，相比會隨著鹽用量先快速增大，后緩慢減小。所以結(jié)合圖1和圖2，必須同時考慮富集因子和相比對雙水相體系萃取OCPs的影響。

2.1.3 無機鹽含量對OCPs萃取率的影響 由于高的富集因子和低的相比有利于藥物的富集，所以我們比較了不同鹽含量的雙水相體系對OCPs萃取率的大小。固定體系中加入5.0 mL水、2 mL乙腈和 0.05 μg OCPs，當(dāng) NaC2H3O2、(NH4)2SO4、K2HPO4和 KC2H3O2的含量分別為 1.5 ～2.5 g，0.5～2.3 g，1.0 ～2.0 g和 1.0 ～3.0 g時，各體系對 9種OCPs的萃取率大小見圖3中a～d所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，K2HPO4-CH3CN-H2O體系對α-BHC和o，p-DDT萃取率均偏低;而NaC2H3O2-CH3CN-H2O體系在分相后，上相體積太小，不便于實際樣品的檢測;其余兩種鹽(NH4)2SO4和KC2H3O2，使用一定的量與乙腈、水組成雙水相體系，對9種OCPs的萃取不但高效而且穩(wěn)定。

圖3 不同鹽含量的雙水相體系對9種OCPs的萃取率Fig.3 Extraction efficiency of 9 OCPs in acetonitrile-salt-H2O with different amount of salt

2.1.4 乙腈含量對富集因子和OCPs萃取率的影響 根據(jù)2.1.2節(jié)和2.1.3節(jié)討論，固定各雙水相體系中水含量為5 mL，醋酸鉀和硫酸銨的含量分別為1.6 g和1.5 g，比較乙腈含量對體系富集因子及OCPs萃取率的影響，結(jié)果見表1和表2。

由表1、表2可知，隨著乙腈含量的增加，兩種體系的富集因子均明顯下降，而OCPs萃取率卻是緩慢升高后趨于平衡。由于高的萃取率和合適的富集因子是痕量分析的關(guān)鍵，結(jié)合此兩種因素，并且考慮到實際操作可行性，發(fā)現(xiàn)醋酸鉀-乙腈-水體系不但萃取率高，而且富集效果明顯優(yōu)于硫酸銨-乙腈-水體系，所以最終選擇乙腈、醋酸鉀、水配比為2.0～3.0 mL ∶1.6～2.1 g ∶5 mL 的雙水相體系來萃取OCPs。

表1 乙腈-醋酸鉀-水體系中乙腈含量對OCPs萃取率的影響Table 1 Effect of the volume of acetonitrile on extraction efficiencies of 9 OCPs in CH3CN-KC2H3O2-H2O

表2 乙腈-硫酸銨-水體系中乙腈體積對OCPs萃取率的影響Table 2 Effect of the volume of acetonitrile on extraction efficiencies of 9 OCPs in CH3CN-(NH4)2SO4-H2O

2.1.5 溫度對OCPs萃取率的影響 實驗研究了不同溫度下，乙腈-醋酸鉀-水體系對OCPs萃取率的大小，結(jié)果見圖4(以 α-BHC、o，p-DDD、o，p-DDE、o，p-DDT和p，p-DDT這5種OCPs為例)。

圖4 溫度對OCPs萃取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction efficiencies of OCPs

由圖4可知，當(dāng)溫度低于20℃時，不同極性的OCPs萃取率均有不同程度的下降;當(dāng)溫度介于20～40℃時，萃取率穩(wěn)定在80%以上;當(dāng)溫度大于40℃時，極性小的OCPs萃取率有所增大，極性大的卻呈下降趨勢。綜合各種因素，實驗最佳操作溫度應(yīng)為20～30℃。

綜上所述，配比 2.0 ～3.0 mL ∶1.6 ～2.1 g ∶5 mL的乙腈-醋酸鉀-水雙水相體系在室溫下萃取9種OCPs的效果相對最好，可用于魚肉中OCPs殘留分析的樣品前處理中。

2.2 凈化劑的選擇

由于魚肉基質(zhì)雜質(zhì)較多，若要分析其中的OCPs殘留，在雙水相萃取凈化的基礎(chǔ)上，還需要加入有效的凈化劑。根據(jù)文獻報道［26］，實驗篩選了2種凈化效果較好的PSA和C18作吸附劑、硫酸鎂作干燥劑，研究2種凈化劑對OCPs的吸附作用，結(jié)果見表3(以 α-BHC、o，p-DDD、o，p-DDE、o，p-DDT 和 p，p-DDT這5種OCPs為例)。

表3 吸附劑對OCPs回收率的影響Table 3 Effect of sorbents on recoveries of OCPs

由表3可知，PSA和硫酸鎂對有機氯農(nóng)藥的吸附作用很小，基本可忽略不計，而C18對極性大的p，p-DDT有較強的吸附，會對萃取結(jié)果造成很大影響。故針對魚肉中的OCPs殘留，以乙腈-水-醋酸鉀體系作提取劑時，應(yīng)使用PSA和硫酸鎂作為凈化劑。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

將所配制的系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)GC測定。各藥物檢測限為3倍基線噪音對應(yīng)的濃度。9種OCPs的保留時間、回歸方程(y為峰面積，x為質(zhì)量濃度，μg/kg)、相關(guān)系數(shù)以及檢測限見表4。

表4 9種OCPs的保留時間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢測限Table 4 Retention time，regression equations，correlation coefficients and detection limits for the determination of OCPs

2.4 樣品測定

考慮到魚肉中的水分含量，實驗選擇了適當(dāng)配比的乙腈-醋酸鉀-水雙水相體系結(jié)合分散固相萃取法，來提取魚肉中不同添加水平的OCPs殘留，并與國標(biāo)法作了比較(見表5)。9種OCPs加標(biāo)樣品色譜圖，見圖5。

結(jié)果證明，雙水相體系結(jié)合分散固相萃取凈化的前處理方法效果很好，不僅可以將提取、基質(zhì)去除與凈化一次完成，而且9種藥物提取回收率可達(dá)78% ～106%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于11%，和國標(biāo)法相比有了很大提高。

表5 魚肉中9種OCPs添加回收率及精密度Table 5 The recoveries of 9 OCPs in fish by different pretreatment methods(n=4)

圖5 濃度為50 μg/kg的魚肉加標(biāo)樣品色譜圖Fig.5 GC chromatogram of fish samples at a fortified level at 50 μg/kg

3 結(jié)論

室溫下一定配比的乙腈-醋酸鉀-水體系對OCPs萃取率不但高效而且穩(wěn)定，由此建立了一種全新的樣品前處理技術(shù)，即以乙腈-醋酸鉀-水雙水相體系為提取劑，以PSA顆粒為吸附劑，無水硫酸鎂為干燥劑，經(jīng)離心分離去基質(zhì)后，氣相色譜直接進樣分析的方法來提取測定魚肉樣品中的9種OCPs殘留。該方法操作簡單、耗時少，不僅有很好的凈化效果，而且提取回收率較高，明顯優(yōu)于國標(biāo)法，完全能夠滿足魚肉中OCPs殘留的即時高效檢測。

［1］呂惠卿，壽林飛，黃亮，等.加速溶劑萃取/固相萃取凈化/氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定浙貝母中13種有機氯及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留［J］.藥物分析雜志，2010，30(3):491-494.

［2］Natalia F U，Giusepp C，Elisa B G，et al.Solid-phase microextraction as a clean-up and preconcentration procedures for organochlorine pesticides determination in fish tissue by gas chromatography with electron capture detection［J］.J Chromatogr A，2003，1017:35-44.

［3］宋興良，王江濤.加速溶劑萃取-逆基質(zhì)分散固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜法測定海洋生物中六六六殘留量［J］.理化檢驗-化學(xué)分冊，2010，46(9):985-988.

［4］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5009.19—2008食品中有機氯農(nóng)藥多組分殘留量的測定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［5］李攻科，何小青，熊國華，等.用微波消解氣相色譜法測定魚肉中的有機氯農(nóng)藥［J］.分析測試學(xué)報，1999，18(4):5-8.

［6］Philipson L，Albertsson P ，F(xiàn)rick G.The purification and concentration of viruses by aqueous polymer phase systems［J］.Virology，1960，11(3):553-571.

［7］Huddleston J，Veide A，Khler K，et al.The molecular basis of partitioning in aqueous two-phase systems［J］.Trends Biotechnol，1991，9(1):381-388.

［8］Raghavarao K S M S，Rastogi N K，Gowthaman M K，et al.Aqueous two-phase extraction for downstream processing of enzymes/proteins［J］.Enfors S O Lyddiatt A Adv Appl Microbiol，1995，41:97-171.

［9］Trindade I P，Diogo M M，Prazeres D M F，et al.Purification of plasmid DNA vectors by aqueous two-phase extraction and hydrophobic interaction chromatography［J］.J Phys Chem A，2005，1082(2):176-184.

［10］Liu H L，He C Y，Wen D W，et al.Extraction of testosterone and epitestosterone in human urine using 2-propanolsalt-H2O system［J］.Anal Chim Acta，2006，557(1/2):329-336.

［11］Rosa P A J，Azevedo A M，F(xiàn)erreira I F，et al.Affinity partitioning of human antibodies in aqueous two-phase systems［J］.J Phys Chem A，2007，1162(1):103-113.

［12］Chethana S，Nayak C A，Raghavarao K S M S.Aqueous two phase extraction for purification and concentration of betalains［J］.J Food Eng，2007，81(4):679-687.

［13］Li S H，He C Y，Gao F，et al.Extraction and determination of morphine in compound liquorice using an aqueous twophase system of poly(ethylene glycol)/K2HPO4coupled with HPLC［J］.Talanta，2007，71(2):784-789.

［14］Patil G，Chethana S，Madhusudhan M C，et al.Fractionation and purification of the phycobiliproteins from Spirulina platensis［J］.Bioresour Technol，2008，99(15):7393-7396.

［15］Ferreira L A，Teixeira J A，Mikheeva L M，et al.Effect of salt additives on partition of nonionic solutes in aqueous PEG-sodium sulfate two-phase system［J］.J Phys Chem A，2011，1218(31):5031-5039.

［16］Renard J A，Oberg A G.Ternary systems:Water-acetonitrile-salts［J］.J Chem Eng Data，1965，10(2):152-155.

［17］Renard J A.Ternary systems:Water-acetonitrile-salts［J］.J Chem Eng Data，1966，11(2):169-171.

［18］Renard J A.Ternary system:Water-acetonitrile-salts［J］.J Chem Eng Data，1967，12(1):33-36.

［19］Renard J A，Heichelheim H R.Ternary system:Wateracetonitrile-salts［J］.J Chem Eng Data，1968，13(4):485-488.

［20］王志華，馬會民，馬泉莉，等.雙水相萃取體系的研究［J］.應(yīng)用化學(xué)，2001，18(3):173-175.

［21］Chung N H，Tabata M.Selective extraction of gold(III)in the presence of Pd(II)and Pt(IV)by salting-out of the mixture of 2-propanol and water［J］.Talanta，2002，58(5):927-933.

［22］Chung N H，Nishimoto J，Kato O，et al.Selective extraction of thallium(III)in the presence of gallium(III)，indium(III)，bismuth(III)and antimony(III)by saltingout of an aqueous mixture of 2-propanol［J］.Chim Acta，2003，477(2):243-249.

［23］Nagaosa Y.Extraction-polarographic determination of cobalt(II)and nickel(II)as 2，2'-bipyridine complexes in acetonitrile［J］.Anal Chim Acta，1980，115:81-88.

［24］Yoshida M，Akane A，Nishikawa M，et al.Extraction of thiamylal in serum using hydrophilic acetonitrile with subzero-temperature and salting-out methods［J］.Anal Chem，2004，76(16):4672-4675.

［25］Tabata M，Kumamoto M，Nishimoto J.Ion-pair extraction of metalloporphyrins into acetonitrile for determination of copper(II)［J］.Anal Chem，1996，68(5):758-762.

［26］Li H F，Yin J G，Liu Y M，et al.Effect of protein on the detection of fluoroquinolone residues in fish meat［J］.J Agric Food Chem，2012，60:1722-1727.