曹月林，彭奇均

(江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫 214122)

配體交換色譜是最為簡便有效的拆分DL-氨基酸方法，其中手性固定相起著至關(guān)重要的作用。氨基酸作為廉價易得的手性配體，常用于配體交換手性固定相的合成。自 Dovankov與 Gübitz［1］建立發(fā)展配體交換色譜以來，不同氨基酸配體交換手性固定相時有報道，如 L-脯氨酸固定相［2-4］、L-苯丙氨酸固定相［5-6］、L-羥脯氨酸固定相［7-8］。氨基酸配體在固定相中的含量影響固定相的分離效果，與配體結(jié)合能力較強的待分離物應(yīng)選擇配體鍵合量少的固定相，與配體結(jié)合能力弱的待分離物應(yīng)選擇配體鍵合量高的固定相［9］。氨基酸亦可用于分離其他手性化合物的固定相合成［10］。

在前人的研究中，配體鍵合量的測定均采用元素分析法［3-10］，但元素分析儀器要求高，普通實驗室受儀器制約?？纱嬖胤治龇ㄊ褂玫逆I合量測定方法仍未檢索到。

氨基酸中含有氮元素，氮含量的測定方法較多，如凱氏定氮法［11］、紫外分光光度法［12］等。凱氏定氮法操作繁瑣，需要特定的消解瓶，耗時，耗電，釋放SO2有害氣體;紫外分光光度法操作簡單，普通紫外分光光度計和比色管即可，方便快捷。本文建立了紫外分光光度法測定酪氨酸手性固定相鍵合量的新方法，測定了酪氨酸手性固定相鍵合量，并與元素分析法進行比較，該方法準確可靠，為氨基酸手性固定相鍵合量的測定提供了一種新的參考方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

KH-560鍵合硅膠(38 μm)、酪氨酸手性固定相(38 μm)均為自制;過硫酸鉀、硝酸鉀、氫氧化鈉、氯化鎂、氯化鈣、碳酸鈉、硅酸鈉均為分析純。

TU-1901紫外分光光度計;VARIOEL III元素分析儀;MLS-3750高壓蒸汽滅菌器;AL204電子分析天平。

1.2 實驗原理

氨基酸手性固定相的基質(zhì)是硅膠，其化學(xué)組成為SiO2，不溶于水，但可與強堿反應(yīng)［13］。手性固定相以氫氧化鈉溶液溶解，氨基酸配體游離到溶液中，120～124℃，配體中的有機氮被堿性過硫酸鉀消化為硝酸鹽［12］，見圖1。

圖1 鍵合量測定示意圖Fig.1 Scheme of ligand content determination process

1.3 溶液配制

1.3.1 硝酸根標(biāo)準溶液 按中華人民共和國環(huán)境保護標(biāo)準 HJ 636—2012規(guī)定方法配制10 μg/mL(以氮計)硝酸根標(biāo)準溶液。

1.3.2 樣品待測液的制備 準確稱取酪氨酸手性固定相0.1 g于10 mL比色管中，加入2 mL 0.6～1.0 mol/L NaOH溶液，55～75℃水浴至固定相全部溶解，冷卻，稀釋至刻度。

1.3.3 消化液的制備 取1.0～2.0 mL樣品待測液于25 mL比色管中，按中華人民共和國環(huán)境保護標(biāo)準 HJ 636—2012規(guī)定方法進行消化，稀釋至25 mL。

1.4 硝酸根標(biāo)準曲線的繪制

按中華人民共和國環(huán)境保護標(biāo)準 HJ 636—2012規(guī)定方法進行繪制，見圖2。

圖2 硝酸根標(biāo)準曲線Fig.2 Standard curve of nitrate ion

1.5 實驗方法

取消化液 5 mL于 25 mL比色管中，加入3 mL 1 mol/L氯化鎂(氯化鈣)，搖勻，加水稀釋至10 mL，靜置 60 min。取上清液于帶孔徑 ＜0.45 μm的針式過濾頭的一次性注射器中，將濾液過濾至10 mm比色皿中。以水為參比，測定275，220 nm下吸光度［12］，校正吸光度 A=A220－2A275。同時設(shè)置KH-560鍵合硅膠為空白。按下式計算:

式中 cN——扣除空白后的A帶入線性方程計算硝態(tài)氮濃度，μg/mL;

V——溶液稀釋體積，mL;

n——氨基酸分子中氮原子個數(shù);

m固——固定相樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定相溶解條件的確定

取0.1 g酪氨酸手性固定相于10 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液中，不同水浴溫度下溶解，至完全溶解的時間見表1。

表1 不同氫氧化鈉濃度和溶解溫度下固定相溶解時間Table 1 Dissolved times of CSP in sodium hydroxide with different concentrations at different temperatures

由表1可知，同一溫度下，氫氧化鈉濃度不影響溶解時間，隨溫度升高，溶解時間縮短，95℃需2.5 min，75 ℃需4.5 min，55 ℃需16 min。95 ℃時水浴溫度高，不易控制，75℃水浴條件相對溫和且固定相可快速溶解。

取10 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液，準確加入0.1 g固定相，75℃水浴溶解，待溶解后繼續(xù)加入，至不再溶解，加至2 g，冷卻，過濾，烘干稱重，計算溶解度，結(jié)果見表2。

表2 不同濃度氫氧化鈉溶液中固定相溶解度Table 2 Solubility of CSP in sodium hydroxide with different concentrations

由表2可知，固定相溶解度與氫氧化鈉濃度呈正相關(guān)，氫氧化鈉濃度在0.4～1.0 mol/L，濃度每增加0.2 mol/L，溶解度增加約3.7 g，固定相溶解的實質(zhì)是基質(zhì)中的二氧化硅與氫氧化鈉的反應(yīng)，氫氧化鈉總量決定了固定相溶解量。實際溶解過程中，取0.1 g固定相，加入2 mL 濃度0.6 ～1.0 mol/L 氫氧化鈉溶液，即固液比為1∶20(m∶V)，可保證固定相全部溶解。確定溶解條件為:氫氧化鈉濃度0.6～1.0 mol/L，75 ℃，固液比1∶20(m∶V)。

2.2 測定條件的確定

2.2.1 干擾物的確定 過硫酸鉀將有機氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，有機碳被轉(zhuǎn)化為碳酸根［14］，同時體系中含有硅酸根。硝態(tài)氮在 220，275 nm雙波長下測定［12］，結(jié)果見圖 3。

圖3 紫外光譜Fig.3 UV spectrograms

由圖3可知，硅酸根、碳酸根在220 nm處產(chǎn)生干擾，使測定結(jié)果偏大。測定時應(yīng)除去硅酸根和碳酸根。硅酸根和碳酸根的鎂鹽、鈣鹽是難溶或微溶于水的沉淀［13］，沉淀法可有效除去硅酸根和碳酸根。沉淀劑應(yīng)在220 nm和275 nm處無吸收。由紫外光譜可知，氯化鎂和氯化鈣是良好的沉淀劑。

2.2.2 過濾介質(zhì)的影響 取適量固定相消化液于25 mL比色管中，加入沉淀劑，分別以濾紙和針式濾頭(0.8，0.45，0.22 μm)過濾，測定 220，275 nm 吸光度，結(jié)果見表3。

表3 過濾介質(zhì)的影響Table 3 Influence of filter media

由表3可知，濾紙和0.8 μm針式過濾頭孔徑過大，無法除去細小沉淀顆粒，使A220、A275大于沉淀前。針式過濾頭孔徑小于0.45 μm，275 nm處基本無吸收，A220趨于穩(wěn)定。過濾時應(yīng)取孔徑＜0.45 μm的針式過濾頭過濾。

2.2.3 靜置時間的影響 取5 mL消化液，加入5 mL 1 mol/L的沉淀劑，結(jié)果見圖4。

圖4 靜置時間的影響Fig.4 Influence of quiescence time

由圖4可知，氯化鎂作為沉淀劑，需靜置至少60 min。硅酸鎂難溶于水［13］，直接以沉淀形式析出。碳酸鎂微溶于水［13］，在水中其水解成難溶的氫氧化鎂［15］:

靜置過程不僅使沉淀沉降便于過濾，同時使碳酸鎂水解成氫氧化鎂，測定結(jié)果更加準確。氯化鈣作為沉淀劑，無需靜置，硅酸鈣、碳酸鈣均難溶于水［13］，以沉淀形式析出。但實際操作中，不靜置直接過濾，濾頭堵塞，過濾困難，靜置60 min使沉淀沉降是必要的。

2.2.4 沉淀劑加入量的影響 在前述確定的條件基礎(chǔ)上，取5 mL消化液，加入1～5 mL濃度1 mol/L的沉淀劑，結(jié)果見圖5。

圖5 沉淀劑用量的影響Fig.5 Influence of precipitating agent dosage

由圖5可知，氯化鎂和氯化鈣用量小于3 mL，干擾物排除不完全，校正吸光度偏大;≥3 mL后，硅酸根、碳酸根被完全沉淀，校正吸光度趨于穩(wěn)定。同時，實驗中發(fā)現(xiàn)，由于消化液中存在由過硫酸鉀轉(zhuǎn)化的硫酸根［12］，氯化鈣加入量過多，生成微溶的硫酸鈣，沉淀量增加，易堵塞濾頭，難以過濾。以氯化鈣為沉淀劑，加入量以3 mL為宜。

2.3 酪氨酸固定相樣品鍵合量測定

2.3.1 方法精密度及加標(biāo)回收率 取樣品待測液1.0 ～2.0 mL，按實驗方法進行測定，結(jié)果見表4。

表4 精密度實驗結(jié)果Table 4 Reproducibility of determination of ligand content

由表 4可知，固定相溶液取樣量在 1.0～2.0 mL，多次測定結(jié)果的相對標(biāo)準偏差(RSD)均＜2%，證明本方法的精密度較高。

分別取同一酪氨酸固定相樣品待測液1 mL于25 mL比色管中，加入0～3 mL 10 μg/mL NO3－標(biāo)準溶液，測定本底量和加標(biāo)測出量，以硝態(tài)氮含量計，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表5。

表5 加標(biāo)回收率Table 5 Results of recovery

由表5可知，加標(biāo)回收率在98.0% ～104%，說明該方法可靠，測定準確度較高。

2.4 對比實驗

分別采用紫外分光光度法和元素分析法測定酪氨酸固定相鍵合量。元素分析法在CHNS模式(爐1:1 150℃，爐2:850℃)下進行，按下式計算鍵合量(μmol/g)，結(jié)果見表 6。

式中 N鍵合硅膠——KH-560鍵合硅膠氮百分含量，%;

N固——固定相樣品氮百分含量，%;

n——氨基酸分子中氮原子個數(shù)。

表6 兩種方法測定結(jié)果比較Table 6 Comparison of the measurement results of the two methods

由表6可知，兩種方法均能準確測定酪氨酸手性固定相鍵合量，元素分析法與紫外分光光度法相對誤差3.7%，結(jié)果相近。紫外分光光度法可作為元素分析法的替代和補充方法使用。

3 結(jié)論

(1)建立了一種紫外分光光度法測定氨基酸手性固定相鍵合量的新方法。以此方法測得自制酪氨酸手性固定相配體含量為161 μmol/g，RSD＜2%，加標(biāo)回收率在98.0% ～104%，與元素分析法相對誤差3.7%，說明該方法準確可靠。該方法降低了儀器要求，具有較高的廣泛性與普遍性。

(2)該方法的實質(zhì)是測定氨基酸配體中的氮元素，亦可用于測定其他氨基酸配體的手性固定相鍵合量，具有一定的通用性。該方法提供了元素分析法之外新的參考方法，具有重要的實用價值。

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