郭永，何森，2，蘇晨，，張瑤楠，王乾興，鄒檢平＊

（1．國(guó)家人口計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京100081；2．沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng)110016；3．遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，遵義563000）

乳腺癌患者中約有2／3的病人使用激素療法，但臨床療效仍不夠理想，目前各國(guó)科學(xué)家都在尋找新型抗乳腺癌藥物。已有研究報(bào)道證實(shí)米非司酮具有抗婦科腫瘤作用，但其機(jī)制尚不明晰，從而制約了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。本研究通過四甲基偶氮唑鹽法（MTT）測(cè)定不同濃度下米非司酮對(duì)乳腺癌MCF-7和T47D兩種細(xì)胞系增殖的抑制率，從而分別計(jì)算出兩種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。本實(shí)驗(yàn)研究可為后期開展米非司酮抗乳腺癌分子機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、研究對(duì)象

1．細(xì)胞系：乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7和T47D購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。MCF-7和T47D分別用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．主要試劑：米非司酮（Sigma，美國(guó)），DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、0．25%胰蛋白酶（GIBCO，美國(guó)），MTT、二甲基亞砜（DMSO）（Amerosco，美國(guó)）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．MTT法檢測(cè)細(xì)胞IC50：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7和T47D細(xì)胞，用0．25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，分別以DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS）調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為4×104／ml接種于96孔板，每孔100μl，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，加入米非司酮試劑，使其終濃度分別為0．01、0．1、0．5、1、2．5、10、25、50和100μmol／L，并設(shè)立空白組（不接種細(xì)胞）、對(duì)照組（接種細(xì)胞，但不加米非司酮）。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，各孔均 加 入 20 μl MTT 溶 液 （5mg／ml，即 0．5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。取6個(gè)孔的吸光值均數(shù)，按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率（IR）：IR＝［對(duì)照組光吸收值（OD）值－實(shí)驗(yàn)組OD值］／對(duì)照組OD值×100%。以平均抑制率為Y軸，米非司酮濃度為X軸分別繪制米非司酮濃度對(duì)兩種細(xì)胞抑制率的散點(diǎn)圖。通過直線回歸分別計(jì)算米非司酮對(duì) MCF-7和T47D細(xì)胞的IC50。

2．細(xì)胞處理方法及實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)細(xì)胞IC50實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別用濃度為0．25、2．5、25和50μmol／L米非司酮處理人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D細(xì)胞，處理1、2和3d后分別收集不同處理組細(xì)胞。根據(jù)米非司酮的濃度分為：對(duì)照組（control，以空白溶劑代替米非司酮）、0．25μmol／L組、2．5μmol／L組、25μmol／L組、50μmol／L組。

3．細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：分別在米非司酮處理細(xì)胞1、2和3d后，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化和生長(zhǎng)情況。

4．米非司酮處理后乳腺癌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：根據(jù)米非司酮處理乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D的細(xì)胞IC50結(jié)果，選取4個(gè)濃度梯度進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。待細(xì)胞貼壁后，去上清，加含不同濃度米非司酮（0．25、2．5、25和50μmol／L）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；每24h取出一板培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)液，每孔加入新培養(yǎng)液90μl以及5mg／ml的MTT 10μl，繼續(xù)37℃培養(yǎng)4h；將培養(yǎng)板棄去上清，加入200μl DMSO溶解顆粒物，準(zhǔn)備檢測(cè)。檢測(cè)前搖晃培養(yǎng)板10s，混勻顏色。在酶聯(lián)檢測(cè)儀上，波長(zhǎng)570nm處檢測(cè)各孔的OD；根據(jù)各孔吸光度值，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以（±s）表示，采用單因素方差分析，IR值采用直線回歸分析，以P＜0．05為顯著性差異。

結(jié) 果

一、米非司酮對(duì)MCF-7和T47D細(xì)胞IC50檢測(cè)結(jié)果

米非司酮對(duì)乳腺癌MCF-7和T47D細(xì)胞均有抑制作用，米非司酮作用48h后，其抑制率均隨著米非司酮濃度的增加而變化，存在明顯的量效關(guān)系。米非司酮作用 MCF-7細(xì)胞48h后，1、2．5、10、25、50和100μmol／L組的OD值與對(duì)照組比較，均有顯著性差異（P＜0．05）；而作用于T47D細(xì)胞48h后，2．5、10、25、50和100μmol／L組的 OD 值與對(duì)照組比較，均有顯著性差異（P＜0．05）。通過對(duì)兩種細(xì)胞IR值直線回歸分析，米非司酮對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50為51．21μmol／L，對(duì)T47D細(xì)胞的IC50為54．29μmol／L（表1，圖1）。

表1 不同濃度米非司酮處理MCF-7和T47D細(xì)胞OD值和IR值（±s）

表1 不同濃度米非司酮處理MCF-7和T47D細(xì)胞OD值和IR值（±s）

注：與對(duì)照組比較，＊P＜0．05

組 別MCF-7 T47D OD值 IR值 OD值 IR值0．57±0．04 0．00±0．00 0．54±0．03 0．00±0．00 0．01μmol／L 0．56±0．02 0．93±0．92 0．52±0．02 4．17±0．97 0．1μmol／L 0．55±0．03 4．00±1．03 0．52±0．04 4．04±1．74 0．5μmol／L 0．54±0．07 4．99±1．45 0．51±0．01 6．14±1．99 1．0μmol／L 0．53±0．07＊ 7．74±1．29＊ 0．50±0．02 6．98±2．03 2．5μmol／L 0．52±0．04＊ 9．56±2．18＊ 0．48±0．02＊ 11．82±3．04＊10μmol／L 0．51±0．03＊ 11．35±2．85＊ 0．46±0．06＊ 14．19±4．68＊25μmol／L 0．48±0．05＊ 16．16±3．44＊ 0．43±0．08＊ 19．63±3．23＊50μmol／L 0．18±0．03＊ 68．53±5．68＊ 0．20±0．09＊ 63．36±7．10＊100μmol／L 0．06±0．01＊ 89．41±2．17＊ 0．09±0．09＊ 83．47±4．69對(duì)照組＊

圖1 米非司酮對(duì)乳腺癌MCF-7和T47D細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

二、米非司酮作用乳腺癌細(xì)胞后形態(tài)學(xué)變化

米非司酮作用乳腺癌MCF-7和T47D細(xì)胞后，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞體積變小，細(xì)胞間的鏈接消失，細(xì)胞內(nèi)明顯有黑色小顆粒聚集。25和50μmol／L濃度米非司酮對(duì) MCF-7乳腺癌細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用明顯，特別是50μmol／L干預(yù)24h后即可觀察到貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)小顆粒，在高倍鏡下可見明顯的核質(zhì)濃縮。上述現(xiàn)象隨時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加更加明顯。對(duì)MCF-7和T47D細(xì)胞，低劑量0．25μmol／L組米非司酮處理后細(xì)胞形態(tài)變化均不明顯；但高劑量米非司酮，特別是50μmol／L組干預(yù)3d后，細(xì)胞形態(tài)變化明顯，由貼壁狀態(tài)變化為懸浮狀態(tài)，說明有細(xì)胞死亡（圖2、3）。

三、米非司酮處理乳腺癌細(xì)胞后細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

不同濃度的米非司酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF－7和T47D的增殖均有抑制作用，且呈濃度依賴性。隨著米非司酮濃度的增加，增殖抑制作用越顯著（圖4、5）。

討 論

圖2 米非司酮處理后MCF-7形態(tài)學(xué)觀察（100×）

圖3 米非司酮處理后T47D形態(tài)學(xué)觀察（100×）

圖4 米非司酮處理后乳腺癌細(xì)胞系MCF-7生長(zhǎng)曲線

圖5 米非司酮處理后乳腺癌細(xì)胞系T47D生長(zhǎng)曲線

乳腺癌發(fā)病率已經(jīng)占據(jù)全球女性惡性腫瘤的首位，是世界上五大惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的數(shù)據(jù)，全世界乳腺癌年發(fā)病人數(shù)高達(dá)120萬人，年死亡人數(shù)約為50萬。目前臨床上治療乳腺癌的常規(guī)藥物有希羅達(dá)（卡培他濱片）、芙瑞（來曲唑片）、速萊（依西美坦片）、赫賽?。ㄗ⑸溆们字閱慰梗┑?，但各自有不同的臨床適應(yīng)癥。乳腺癌患者多使用激素療法［1］，主要藥物有三苯氧胺、甲孕酮、甲地孕酮等，這類藥物的作用機(jī)理都是阻斷人雌激素來源，目前有效率僅為30%～50%，臨床療效仍不夠理想［2－4］。現(xiàn)在科學(xué)家們都在尋找新型內(nèi)分泌治療乳腺癌的藥物。米非司酮是孕酮受體拮抗劑，米非司酮分子式為C29H35NO2，化學(xué)結(jié)構(gòu)為17β羥-11β［4-二甲基苯胺］-17-丙炔基-4，9雙烯-3酮，在上個(gè)世紀(jì)由法國(guó)Roussel-Uclaf公司合成，原代號(hào)RU-486。作為一種人工合成的炔諾酮衍生物，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)與孕酮相似，具有甾體結(jié)構(gòu)，能與孕酮受體結(jié)合，產(chǎn)生較強(qiáng)的抗孕酮作用，主要應(yīng)用于終止早孕，同時(shí)也有抗著床、誘導(dǎo)月經(jīng)及促進(jìn)宮頸成熟等作用［5］。自1993年 Murphy等人［6］首次發(fā)表了米非司酮能縮小子宮肌瘤的臨床報(bào)道以來，大量的研究報(bào)道已經(jīng)證實(shí)米非司酮具有抗腫瘤作用，包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮平滑肌瘤等婦產(chǎn)科腫瘤［7－11］。

在新型抗乳腺癌藥物的篩選過程中，各種乳腺癌細(xì)胞系的應(yīng)用起了不可忽視的作用，這些來自于不同遺傳背景的、具有不同激素受體表型的乳腺癌細(xì)胞系為體內(nèi)外研究乳腺癌的生物學(xué)特性、治療提供了有形的載體，涉及到新型藥物發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)和臨床前研究等各個(gè)方面。在細(xì)胞生物學(xué)方面，本研究選用的兩個(gè)乳腺癌細(xì)胞系各有其代表性：MCF-7為人乳腺癌上皮細(xì)胞系，雌激素受體（ER）和孕酮受體（PR）為陽(yáng)性［12］；T47D 為人乳腺導(dǎo)管癌上皮細(xì)胞系，ER陰性，PR雖然為陽(yáng)性［13］，但不受雌二醇調(diào)控。這兩種細(xì)胞在病理分型、激素受體亞型上均不相同，因此本研究選用這兩種細(xì)胞系對(duì)米非司酮進(jìn)行研究具有較好的代表性。在藥理學(xué)研究方面，IC50，是指“生物學(xué)反應(yīng)”被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度。在細(xì)胞增殖方面，可以理解為一定濃度的某種藥物抑制腫瘤細(xì)胞的50%停止增殖，該濃度稱為50%抑制濃度，即不增殖細(xì)胞與全部細(xì)胞數(shù)之比等于50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，IC50值可以用來衡量藥物抑制增殖的能力，即抑制能力越強(qiáng)，該數(shù)值越低，也可以反向說明某種細(xì)胞對(duì)藥物的耐受程度。該指標(biāo)是抗腫瘤藥物篩選及臨床前研究中得重要方法，對(duì)于后續(xù)藥物功能和機(jī)制得研究至關(guān)重要。

本研究結(jié)果表明：經(jīng)過3d5組不同濃度的米非司酮處理，米非司酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性，隨劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，米非司酮對(duì)乳腺癌的抑制作用越強(qiáng)。在低劑量處理組（0．25μmol／L和2．5μmol／L）中以抑制細(xì)胞增殖為主，在高劑量組（25μmol／L和50μmol／L）中可能同時(shí)以抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡為主，不同劑量對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制作用的分子機(jī)制及其與臨床應(yīng)用上的相關(guān)性將是我們下一步深入研究的內(nèi)容。

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