張尉，侯麗，周越，辛玲，杜江，郭穎，高娜娜，賴仞，王慧萍＊，于和鳴＊

（1．北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京100730；2．國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京100081；3．中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明650223）

壬苯醇醚-9（Nonoxinol-9，N-9）因其具有強大的殺精效果成為廣泛接受的表面活性劑類殺精劑［1］，已經(jīng)在美國和其他一些國家使用超過了30年［2］。作為一種有效的殺精避孕陰道外用生物制劑，除了擁有快速有效的殺精避孕性質(zhì)之外，安全低毒也非常重要。但近年來有研究表明，N-9存在安全隱患，長期反復(fù)使用可能會對子宮內(nèi)膜上皮細胞造成損傷［3－4］，所以盡快研制新型安全的殺精避孕劑已迫在眉睫。抗菌肽（Antimicrobial peptides）是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類抵抗外源性病原微生物致病作用的防御性小分子多肽（分子質(zhì)量＜10ku），是宿主固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分［5］。每種抗菌肽都有其特定的抗菌譜，部分抗菌肽還兼具殺精子作用（如 Magainin）［6－7］。因此，抗菌肽成為近年來國內(nèi)外殺微生物劑研發(fā)的熱點。其中線性陽離子多肽Maximin是賴仞課題組最早從中國大蹼鈴蟾（Bombina maxima）皮膚中分離提取的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的先導(dǎo)化合物［8］（專利號：ZL 00122415．8），該化合物具有廣譜抗菌、抗腫瘤細胞、抗HIV等特點，并與同濃度的國外Magainin具有相似的精子制動活性［9］，故成為本實驗殺精分析首選抗菌肽。為了優(yōu)化Maximin的殺精活性，在原有的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，賴仞課題組對其結(jié)構(gòu)進行了一系列改良。本文通過對19種抗菌肽Maximin衍生物（M1～M19）進行體外殺精和細胞毒性作用的評價，篩選出有望成為安全、有效的新型體外殺精劑的候選物。

材料與方法

一、研究對象

1．精液采集及分析：精液樣品來源于北京市人類精子庫（注冊登記號：006184110108171012）。選擇育齡、健康和有正常生育史的男性志愿者48例，年齡為25～35歲，取精前禁欲72h，手淫法獲取精液（精液量＞2ml），于37℃保溫液化30min。液化后進行常規(guī)分析，嚴(yán)格按照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版［10］推薦的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，其中精子總數(shù)60×106～100×106／ml，精液濃度＞20×106／ml，精子活動率＞60%。本實驗經(jīng)過國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，征得志愿者知情同意。

2．藥品：19種抗菌肽 Maximin衍生物（M1～M19）由吉爾生化（上海）有限公司合成，液相色譜（HPLC）分析進行純度鑒定，純度≥95%。用生理鹽水將Maximin衍生物配制成4×105mg／L的儲備液，4℃貯存，臨用前生理鹽水稀釋成相應(yīng)濃度。

3．細胞株：人宮頸癌細胞株 Hela-229由山東省腫瘤防治研究院韓建軍副主任醫(yī)師惠贈，采用含10% 胎牛血清的DMEM（pH 7．4）完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

4．試劑：N-9（Igepal CO630，Sigma，美國）、DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO，美國）、胎牛血清（GIBCO）、0．25% 胰 蛋 白 酶 （GIBCO）、PBS（Hyclone，美國）、CCK-8（日本同仁化學(xué)研究所）、伊紅－苯胺黑（深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

5．主要儀器：光學(xué)顯微鏡（LW100B，中國上海），血細胞分類計數(shù)器［XK06-9J，普賽德（北京）儀器設(shè)備有限公司］，凈工作臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠），CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國），酶聯(lián)免疫檢測儀（Multiskan MK3，Thermo，美國）。

二、研究方法

1．體外殺精實驗：按照 WHO推薦的Sander-Cramer方法［11］，將工作濃度均為2 000mg／L 的Maximin衍生物（M1～M19）分別與精液以5∶1的比例混合，在盡可能短的時間內(nèi)用移液管反復(fù)吹打5次，使之充分混勻，37℃水浴孵育。藥物與精液混合后開始計時，20s后立即取20μl混合液置載玻片上，高倍顯微鏡（×400）下觀察計數(shù)。隨機觀察5個高倍鏡視野，若有活動精子，計數(shù)200個精子，活動率＝（活動精子數(shù)／精子總數(shù)）×100%。每組用3位供精者的精液，每份標(biāo)本重復(fù)測2次，以生理鹽水作為陰性對照，臨用前測定生理鹽水的原始pH值。

2．測定精子存活率實驗：伊紅－苯胺黑染色技術(shù)用以觀察精子的存活率［10，12］。將混合液與等量的伊紅－苯胺黑染料充分混合，靜置30s，吸少許染液在載玻片上制成涂片，空氣中干燥后，油鏡下觀察計數(shù)，被染色的精子記為死精子，未被染色的精子記為活精子。

3．EC100的測定：瞬間殺精效果可以用EC100來表示，即20s能夠100%制動精子的最低濃度［13］。將初篩具有明顯殺精效果的抗菌肽分別配制成500、1 000、1 500和2 000mg／L四種濃度梯度的溶液，采用Sander-Cramer方法，作用時間20s，同上顯微鏡下計數(shù)活精子，每份標(biāo)本重復(fù)測定3次，繪制出EC100曲線圖。

4．抗菌肽細胞毒性研究：本實驗采用CCK－8試劑盒檢測抗菌肽和 N-9對 Hela-229的細胞毒性［14］。將具有較強殺精作用的五種抗菌肽 M1、M7、M11、M15和M17用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋分別成125、250、500和1 000mg／L 4種濃度梯度。首先以125mg／L 24h的細胞毒性作為標(biāo)準(zhǔn)，初步觀察細胞毒性大小，然后對毒性較小的抗菌肽用以上四種濃度觀察毒性效果。

將指數(shù)生長期的Hela-229細胞經(jīng)PBS清洗、0．25%胰蛋白酶消化、離心后，用DMEM完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，調(diào)整濃度至1×105細胞／ml，接種于96孔板，每孔100μl，每個濃度組設(shè)5個平行孔，并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；次日更換新鮮的含藥完全培養(yǎng)液100μl，同時以不含藥的培養(yǎng)液作為陰性對照，含N-9的培養(yǎng)液作為陽性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，快速加入10μl的CCK-8，并使之均勻分布于孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，在酶標(biāo)儀上測定各孔的OD值，采用雙波長方法，測定波長為450nm，參比波長為650nm。按照如下公式計算細胞的存活率：細胞存活率（%Cell viability）＝［（AS－Ab）／（AC－Ab）］×100%，其中 AS為實驗孔平均值（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、毒性物質(zhì)），AC為對照孔平均值（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有毒性物質(zhì)），Ab為空白孔平均值（不含細胞和毒性物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8）。

N-9用 DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋成1．25、2．5、5和10mg／L 4種濃度梯度作為實驗組，以不加N-9的培養(yǎng)基作為陰性對照組，測定N-9對Hela-229的24h細胞毒性和半數(shù)抑制量（I C50），同上酶標(biāo)法檢測計算細胞存活率。

5．抗菌肽殺精作用的時間－濃度依賴性測定：將抗菌肽配制成1 000、500、250和125mg／L的實驗液，應(yīng)用Sander-Cramer方法，分別測定20、40、60和120s時的精子活力，以生理鹽水作為陰性對照，N-9（100mg／L）作為陽性對照。測定完畢之后，繪制出抗菌肽的時間－濃度依賴性曲線。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 17．0軟件進行分析，采用方差檢驗法對數(shù)據(jù)進行分析。

結(jié) 果

一、抗菌肽的體外殺精效果

利用Sander-Cramer方法對收集到的符合條件的精液進行20s殺精處理，結(jié)果顯示（表1），19種抗菌肽衍生物（M1～M19）中 M1、M7、M11、M15、M17在濃度為2，000mg／L時均能完全制動精子。陰性對照為生理鹽水（pH7．4）。用伊紅－苯胺黑染色觀察的精子存活率實驗，結(jié)果表明2，000mg／L時5種抗菌肽作用之后精子無一存活。

表1 Maximin衍生物（M1～M19）殺精作用初篩（n＝3）

二、EC100測定結(jié)果

將5種具有明顯殺精效果的抗菌肽 M1、M7、M11、M15和M17分別進行EC100的測定。結(jié)果顯示（圖1），五種抗菌肽的EC100分別是：M7＝M11＝2 000mg／L，M1＝M15＝M17＝1 500mg／L，說明M1、M15和 M17的瞬間殺精效果（20s）優(yōu)于 M7和M11。

三、N-9對Hela-229的細胞毒性分析結(jié)果

利用1．25、2．5、5和10mg／L 4種濃度梯度分析N-9對Hela-229的細胞毒性。結(jié)果如圖2所示，N-9表現(xiàn)出較強的細胞毒性作用，毒性隨濃度的增長而增大，并有顯著性差異（P＜0．05）。據(jù)此數(shù)據(jù)算得 N-9的半抑制率IC50＝3．01mg／L。

圖1 五種抗菌肽的EC100曲線圖

圖2 N-9對 Hela-229的細胞毒性作用（n＝5）

四、Maximin衍生物細胞毒性初篩

將5種具有明顯殺精效果的抗菌肽M1、M7、M11、M15和M17分別進行細胞毒性初篩，實驗結(jié)果如表2所示，5種抗菌肽在125mg／L時，對Hela－229細胞的24h毒性分別是M11＜M15＜M17＜M7＜M1。

表2 5種Maximin衍生物對Hela-229細胞毒性作用初篩［（n＝5），（±s）］

表2 5種Maximin衍生物對Hela-229細胞毒性作用初篩［（n＝5），（±s）］

藥物濃度125mg／L 細胞存活率（%）M1 8．27± 0．47 M7 13．58± 1．76 M11 102．84± 3．76 M15 94．41±10．48 M17 43．38± 5．74

五、M11、M15和M17對Hela-229的細胞毒性分析結(jié)果

經(jīng)過細胞毒性初篩分析，M11、M15和M17三種抗菌肽的細胞毒性較小。將三種抗菌肽配制125、250、500和1 000mg／L 4種濃度梯度，進一步分析其細胞毒性情況。結(jié)果顯示，M11的細胞毒性最小，M15和M17的細胞毒性相對較強，毒性隨濃度的增大而增大，并具有顯著性差異（P＜0．05）（圖3）。

圖3 M11、M15和M17對Hela-229的細胞毒性作用（n＝5）

六、抗菌肽M11殺精作用的時間－濃度依賴性測定

將具有較強殺精效果和低細胞毒性的抗菌肽M11與精液以不同濃度梯度（125，250，500和1 000 mg／L）在不同時間點（20、40、60和120s）下分析其殺精效果。結(jié)果表明M11的殺精效果具有時間依賴性和濃度依賴性（圖4）。

圖4 M11殺精作用的時間－濃度依賴性曲線

討 論

在近幾十年間，許多抗菌肽分子已經(jīng)從各種生物體中分離得到，已有部分抗菌肽應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)、生物醫(yī)藥業(yè)以及臨床治療等領(lǐng)域［15］，但有關(guān)抗菌肽殺精避孕方面的研究卻相對較少，國外也僅有為數(shù)不多的抗菌肽如 Magainin［7］、Dermasptins［16］等被報道。

本實驗通過對19種抗菌肽Maximin衍生物（M1～M19）在2 000mg／L濃度下進行殺精作用初選，結(jié)果顯示，M1、M7、M11、M15和 M17這5種衍生物具有較強的殺精效果。進一步EC100分析顯示，2 000mg／L時，M7和M11作用20s時均能完全制動精子，而M1、M15和M17在1 500mg／L時即可達到同樣的效果，說明M1、M15和M17的瞬間殺精效果強于M7和M11。

利用Hela-229細胞對初選出的5種具有較強殺精作用的抗菌肽做細胞毒性研究時發(fā)現(xiàn)，125mg／L細胞毒性大?。篗11＜M15＜M17＜M7＜M1。后續(xù)通過深入的濃度梯度毒性研究時發(fā)現(xiàn)，僅有M11表現(xiàn)出幾乎無細胞毒性的特點，其他4種抗菌肽分子都具有較明顯的細胞毒性。因此，我們認(rèn)為，低毒且有較強殺精效果的M11可作為研制安全殺精避孕陰道外用生物制劑的候選物，為進一步體外實驗、動物在體研究提供了參考依據(jù)。

國際上常用的N-9雖然有強大的殺精作用效果（EC100＝100mg／L），但相對 于它的 IC50＝3．01mg／L而言，N-9的細胞毒性非常大，這也印證了相關(guān)文獻報道。而M11則表現(xiàn)出幾乎無細胞毒性的特點，安全性明顯高于N-9。本實驗僅分析了M11的體外殺精作用和對Hela-229的單一細胞毒性作用，尚不全面，在以后的工作中還將對M11對紅細胞細胞毒性、殺精機制、抗陰道常見病菌作用等方面進行分析，同時開展動物體內(nèi)實驗，以期獲得更為全面的數(shù)據(jù)。

［1］ Anuja MM，Nithya RS，Swathy SS，et al．Spermicidal action of a protein isolated from ethanolic root extracts of Achyranthes aspera：an in vitro study ［J］．Phytomedicine，2011，18：776-782．

［2］ Fichorova RN，Tucker LD，Anderson DJ The molecular basis of nonoxynol-9 – induced vaginal inflammation and its possible relevance to human immunodeficiency virus type 1 transmission［J］．J Infect Dis，2001，184：418-428．

［3］ Jain RK，Maikhuri JP，kiran Kumar ST，et al．Novel disulphide esters of carbothioic acid as potent，non-detergent spermicides with low toxicity to Lactobacillus and HeLa cells in vitro［J］．Hum Reprod，2007，22：708-716．

［4］ Zairi A，Tangy F，Bouassida K，et al．Dermaseptins and magainins：antimicrobial peptides from frogs＇skin-new sources for a promising spermicides microbicides-a mini review ［J］．J Biomed Biotechnol，2009，2009：452567．

［5］ Fox MA，Thwaite JE，Ulaeto DO，et al．Design and charaterization of novel hybrid antimicrobial peptides based on cecropin A，LL-37and magaininⅡ ［J］．Peptides，2012，33：197-205．

［6］ Amiche M，Galanth C．Dermaseptins as models for the elucidation of membrane-acting helical amphipathic antimicrobial peptides［J］．Curr pharm Biotechnol，2011，12：1184-1193．

［7］ Clara A，Manjramkar DD，Reddy VK．Preclinical evaluation of magainin-A as a contraceptive antimicrobial agent ［J］．Fertil Steril，2004，81：1357-1365．

［8］ Lai R，Zheng YT，Shen JH，et al．Antimicrobial peptides from skin secretions of Chinese red belly toad Bombina maxima［J］．Peptides，2002，23：427-435．

［9］ 賴仞，梁建國，張云 ．兩棲類皮膚抗菌多肽及其應(yīng)用 ［J］．動物學(xué)研究，2004，25：465-468．

［10］ Cooper TG．WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen ［M］．5thed．World Health Organization，2010．

［11］ Sutyak KE，Anderson RA，Dover SE，et al．Spermicidal activity of the safe natural antimicrobial peptide subtilosin［J］．Infect Dis Obstet Gynecol，2008，540-758．

［12］ Aranha C，Gupta S，Reddy KV．Contraceptive efficacy of antimicrobial peptide Nisin：in vitro and in vivo studies［J］．Contraception，2004，69：333-338．

［13］ Zairi A，Bela?d A，Gahbiche A，et al．Spermicidal activity of dermaseptins［J］．Contraception，2005，72：447-453．

［14］ Kunz C，F(xiàn)ocke F，Saito Y，et al．Base excision by thymine DNA glycosylase mediates DNA-directed cytotoxicity of 5-fluorouracil［J］．PLoS Biol，2009，7：e91．

［15］ 林承德，彭鴻娟，王衍海 ．抗菌肽的應(yīng)用及存在的問題 ［J］．科學(xué)論壇，2007，7：86-90．

［16］ Zairi A，Serres C，Tangy F，et al．In vitro spermicidal activity of peptides from amphibian skin：demaseptin S4and derivatives［J］．Bioorg Med Chem，2008，16：266-275．