王昕宇 楊 劍 安冬青△

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011）

新疆地區(qū)冠心病穢濁痰阻證動物模型的實驗研究*

王昕宇1楊 劍2安冬青1△

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011）

目的通過人工氣候箱結(jié)合喂養(yǎng)高脂飼料并腹腔注射維生素D3，建立新疆地區(qū)冠心病穢濁痰阻證大鼠模型。通過組織切片、血清指標(biāo)，摸索模型建立條件。方法按RCT原則，將20只SD大鼠分為空白對照組、穢濁痰阻證模型組，每組10只?？瞻讓φ战M正常飲水喂基礎(chǔ)飼料；穢濁痰阻證模型組正常飲水喂高脂飼料并腹腔注射維生素D3，同時每日固定11 h在人工氣候箱寒燥條件下飼養(yǎng)。實驗第13周，行大鼠主動脈瓣至髂腎動脈分支處動脈及肝臟組織切片檢查；測體質(zhì)量、血清總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、血清白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子-α。結(jié)果兩組大鼠體質(zhì)量、血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、IL-6、TNF-α差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；動脈血管壁內(nèi)膜下見無定形物質(zhì)沉積，有泡沫樣細(xì)胞；肝組織外周出現(xiàn)中度肝脂肪變性。結(jié)論冠心病穢濁痰阻證大鼠模型，基本表現(xiàn)出新疆地區(qū)冠心病穢濁痰阻證辨證要點，初步推測造模方法具有一定可行性。

冠心病穢濁痰阻證大鼠模型 血脂 組織切片 白細(xì)胞介素6 腫瘤壞死因子α

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦莿用}粥樣硬化導(dǎo)致器官病變的最常見類型。胸痹心痛根據(jù)其臨床證狀特點，類似于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)之冠心?。?］。本課題組對新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院心血管?？凭驮\的2215例確診為冠心病的患者的辨證分型及常見癥狀的發(fā)生頻度分析，發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)胸痹以五臟虛損、穢濁痰濕阻于脈絡(luò)形成血瘀，氣虛、穢濁痰濕、瘀血交織最為多見，即穢濁痰阻氣虛血瘀證是新疆地區(qū)胸痹的主要證型［2］；誘發(fā)因素包括年齡、脂質(zhì)代謝異常、高血壓、肥胖、飲食、寒冷、干旱少雨、沙塵風(fēng)暴、沙塵花粉等［3-4］。本課題組將誘發(fā)冠心病的危險因素與新疆地區(qū)冠心病穢濁痰阻證的證候結(jié)合，嘗試建立“病證結(jié)合”的動物模型，以探討冠心病的病理、生理變化與中醫(yī)證候特征之間的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量（160± 20）g，新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（通過北京動物管理委員會評估認(rèn)證）。飼養(yǎng)條件：標(biāo)準(zhǔn)飼料，溫度（22±2）℃，相對濕度40％～70％，通風(fēng)光照良好。

1.2 藥物與試劑 藥物：膽固醇（北京化學(xué)試劑公司，批號010927）、去氧膽酸鈉 （廣東環(huán)凱微生物科技公司，批號200701023）、丙基硫氧嘧啶（深圳市中聯(lián)制藥有限公司，批號0610312）、維生素D3（上海第九制藥廠，批號980802）。試劑：血清總膽固醇（T-CHO）試劑盒（貨號A030，批號200804011）、三酰甘油（TG）試劑盒（貨號A035，批號200704032）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（貨號A027，批號200706120）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒（貨號A028，批號200804091）、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）試劑盒（貨號A029，批號200803225）、大鼠血清白細(xì)胞介素6（IL-6）試劑盒（批號201011215）、大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號201007421），均購自長春匯力生物技術(shù)有限公司；10％甲醛固定液，10％烏拉坦溶液等。

1.3 儀器 MIC400人工氣候箱 （上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、臺式天平、C390高速低溫離心機（Sigma公司）、分離膠采血管、OLYMPUS-AU5421型全自動生化分析儀 （日本O-LYMPUS公司）、OLYMPUS BH-2熒光顯微鏡 （日本OLYM-PUS公司）、LEICA RM2135型切片機（德國LEICA公司）、酶標(biāo)儀。

1.4 分組及給藥 分組：按RCT原則，將20只SD雄性大鼠分為空白對照組、穢濁痰阻證模型組，每組10只。高脂飼料制備：71.3％的標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)飼料中，加入3％膽固醇、0.5％去氧膽酸鈉、0.2％丙基硫氧嘧啶、5％白糖、20％豬油（將各物人工充分混勻，再經(jīng)加熱溶化的豬油攪拌，壓成圓條狀飼料備用）［5-8］。模型制備：造模共12周。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨后開始正式實驗。在喂食高脂飼料第1周第1日，第1次腹腔注射維生素D360萬IU/kg；第5周第1日，第2次腹腔注射維生素D360萬IU/kg；第9周第1日，第3次腹腔注射維生素D360萬IU/kg；空白對照組相同時間，3次腹腔注射同等單位0.9％氯化鈉注射液［5-8］。同時，穢濁痰阻證模型組大鼠，每日9∶00～20∶00，放入人工氣候箱。人工氣候箱系統(tǒng)設(shè)定為（6±2）℃，相對濕度25％～32.8％［9-10］。以模擬新疆地區(qū)環(huán)境。

1.5 動物處理及指標(biāo)檢測 實驗第13周第1日，處死19只大鼠（模型組1只大鼠實驗中途死亡），行大鼠主動脈瓣至髂腎動脈分支處動脈及肝臟組織病理切片檢查；檢測體質(zhì)量、血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、IL-6、TNF-α。

1.6 主動脈瓣至髂腎動脈分支處動脈、肝臟組織切片檢查 實驗第13周，兩組大鼠禁食不禁水12 h，用10％烏拉坦溶液（0.01 mL/kg）麻醉，沿主動脈瓣至髂腎動脈分支處剝離動脈，縱向剪開，在10％甲醛溶液中固定3 d；將新鮮采集的肝臟組織置10％甲醛溶液固定3 d。兩部分標(biāo)本行脫水、二甲苯透明、三步石蠟法制病理切片，光鏡觀察截取圖片。

1.7 血脂、IL-6、TNF-α檢測 實驗第13周，將兩組大鼠禁食不禁水12 h，用10％烏拉坦溶液 （0.01 mL/kg）麻醉，用分離膠心臟采血管采血5 mL，高速低溫離心機3500 r/min離心10 min，2～8℃靜置。行TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL-C檢測；IL-6、TNF-α（ELISA）檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，正態(tài)性、方差齊用單因素方差分析LSD檢驗，方差不齊用單因素方差分析的Dunnett’s T3檢驗。非正態(tài)性資料用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)指征評價及死亡情況 空白對照組大鼠精神狀態(tài)良好，毛色較白有光澤，目睛光亮有神，反應(yīng)靈敏，飼喂時有較大反應(yīng)，不斷抓撓食盒，舌質(zhì)暗紅，舌無苔，大便干結(jié)成顆粒狀。穢濁痰阻證模型組大鼠從3周左右開始發(fā)現(xiàn)精神欠佳，目光呆滯，活動少，飲食減少；7周左右飼喂時較少有反應(yīng)，喜臥少動，飲食有所減少，毛色變暗；10周左右發(fā)現(xiàn)目睛混濁，飲食略有增加。舌質(zhì)暗紫有瘀斑，舌苔薄膩、大便黏滯不成形。穢濁痰阻證模型組4號大鼠，因厭食、逐漸消瘦致體質(zhì)較差，于實驗第5周死亡，未行尸檢。造模成功率95％。

2.2 兩組大鼠體質(zhì)量比較 造模后空白組大鼠平均體質(zhì)量為（336.0800±31.5062）g，穢濁痰阻證模型組大鼠平均體質(zhì)量為（225.1111±34.6751）g，穢濁痰阻證模型組大鼠體質(zhì)量較造模前明顯增高，但較之空白對照組，體質(zhì)量偏低（P＜0.05）。

2.3 兩組大鼠血脂指標(biāo)及IL-6、TNF-α比較 見表1，表2。結(jié)果示T-CHO、LDL-C、VLDL-L、IL-6、TNF-α差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而TG、HDL-C差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組大鼠造模后血脂指標(biāo)比較（mmol/L，±s）

表1 兩組大鼠造模后血脂指標(biāo)比較（mmol/L，±s）

與穢濁痰阻證模型組比較，*P＜0.05。下同。

組 別 TG HDL-C空白對照組 1.2800±0.33807 1.3160±0.19283穢濁痰阻證模型組 2.4433±1.18128 1.4600±0.63370 n TC 10 2.0620±0.24912*9 16.1422±9.10956

表2 兩組大鼠造模后血脂、血清指標(biāo)比較（mmol/L，±s）

表2 兩組大鼠造模后血脂、血清指標(biāo)比較（mmol/L，±s）

組 別n IL-6（pg/mL）TNF-α（ng/mL）空白對照組 127.94±32.80* 182.42±17.45*穢濁痰阻證模型組 484.31±171.26 407.71±99.73 10 9 LDL-C（mmol/L）VLDL-C（mmol/L）0.2030±0.03335* 0.5430±0.08433*6.6867±4.19984 7.9956±4.50373

2.4 主動脈瓣至髂腎動脈分支處動脈、肝臟組織切片檢查 主動脈具有早期動脈粥樣硬化（AS）斑塊病理傾向，以動脈分叉開口處較多，說明血流動力學(xué)在AS的進程中起一定作用，在動脈分叉開口處血流方向改變，渦流增加，對動脈內(nèi)膜沖擊損傷作用增強，促進AS病變形成。

2.5 組織切片比較 組織切片顯示穢濁痰阻證模型組大鼠動脈及肝臟組織均不同程度地出現(xiàn)AS早期病理表現(xiàn)，即動脈以內(nèi)膜下層泡沫細(xì)胞出現(xiàn)、無定形物質(zhì)沉積為主要表現(xiàn)。

圖1 主動脈瓣至髂腎動脈分支處選取的動脈組織切片比較（×400）

圖2 肝臟組織切片比較（×200）

2.6 主動脈內(nèi)膜厚度、泡沫細(xì)胞比較 見表3。結(jié)果示兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 兩組大鼠主動脈內(nèi)膜厚度、泡沫細(xì)胞比較（±s）

表3 兩組大鼠主動脈內(nèi)膜厚度、泡沫細(xì)胞比較（±s）

組 別 泡沫細(xì)胞（％）空白對照組 3.64±0.54*穢濁痰阻證模型組 35.87±5.71 n 內(nèi)膜厚度（μm）10 11.84±3.68*9 48.41±14.61

3 討論

穢濁痰阻證模型組大鼠TC、LDL-C、VLDL-C均顯著增高，均是誘發(fā)AS病變的危險因素。體質(zhì)量方面，穢濁痰阻證模型組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，一方面與高脂飼料誘發(fā)脂質(zhì)代謝失常密切相關(guān)，導(dǎo)致實驗動物食欲下降；另一方有文獻(xiàn)顯示，高脂飼料結(jié)合維生素D3的造模方法在實驗第10周時，體質(zhì)量會逐漸恢復(fù)增長趨勢［11］。人工氣候箱的寒燥環(huán)境易傷脾胃，使水谷運化失常、久化痰濁、濁氣不降、清氣不升，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)嗜睡懶動、反應(yīng)遲緩、活動能力差、大便黏滯不成形等一系列表現(xiàn)。燥邪侵?jǐn)_，痰濕凝結(jié)于血脈，導(dǎo)致大鼠舌質(zhì)暗紅或暗紫、苔膩。穢濁痰阻證大鼠模型基本表現(xiàn)出新疆冠心病穢濁痰阻證辨證要點。組織切片方面，穢濁痰阻證模型組大鼠動脈及肝臟組織均不同程度出現(xiàn)AS早期病理表現(xiàn)，即動脈以內(nèi)膜下層泡沫細(xì)胞出現(xiàn)、無定形物質(zhì)沉積為主要表現(xiàn)。大鼠TG、HDL-C均無明顯改變，可能與造模時間不足及鼠齡有關(guān)。

由于大鼠無膽囊，對膽固醇等脂質(zhì)吸收少，單純喂食高脂飼料很難誘導(dǎo)大鼠AS的形成，為保證穢濁痰阻證動物模型的成功建立，在人工氣候箱寒燥環(huán)境下，飼料中添加了去氧膽酸鈉，以顯著增加大鼠小腸對膽固醇的吸收量。同時添加丙基硫氧嘧啶，抑制甲狀腺功能、減少大鼠對膽固醇的代謝，以確保血清總膽固醇含量的升高。高糖是另一個誘導(dǎo)AS的因素，在飼料中添加糖粉，不僅能促進血糖升高，且糖分的粘合作用，使高脂飼料易于壓制成顆粒，便于大鼠的食用。維生素D能顯著促進AS的發(fā)生，經(jīng)腹腔注射維生素D3后，血鈣濃度出現(xiàn)顯著升高，破壞動脈管壁內(nèi)皮的完整性［12］。

本實驗利用人工氣候箱，模擬新疆地區(qū)特殊的寒燥氣候，結(jié)合高脂飼料維生素D3混合喂養(yǎng)大鼠，以多樣化致病因素的重疊干預(yù)，反映了穢濁痰阻證的證候臨床特點，初步探索地新疆冠心病穢濁痰阻證“病證結(jié)合”動物模型的建立條件，為課題組系列研究奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

［1］王永炎，嚴(yán)世蕓.實用中醫(yī)內(nèi)科學(xué)［M］.2版.上海：科學(xué)技術(shù)出版社，2009：227.

［2］趙明芬，安冬青.新疆胸痹穢濁痰阻證初步調(diào)查及防治探討［J］.新疆中醫(yī)藥，2008，26（5）：84-86.

［3］周銘心.西北燥證研究概述［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2005，39（11）：43-44.

［4］安冬青，趙明芬，鄭靜，等.新疆胸痹穢濁痰阻證探源［J］.新疆中醫(yī)藥，2007，25（2）：1-2.

［5］楊鵬遠(yuǎn)，芮耀誠，焦亞斌.動脈粥樣硬化大鼠實驗?zāi)Ｐ偷慕ⅲ跩］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，24（7）：802-804.

［6］張均田.現(xiàn)代藥理實驗方法［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)·中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，1998：1263-1271.

［7］郭延松，吳宗貴，楊軍柯，等.三種大鼠動脈粥樣硬化模型復(fù)制方法的比較［J］.中國動脈硬化雜志，2003，11（5）：465-469.

［8］溫進坤，韓梅，杜瑋南，等.一種快速建立大鼠動脈粥樣硬化模型的實驗方法［J］.中國老年學(xué)雜志，2001，21（1）：51-52.

［9］高振，哈木拉提·吾甫爾.關(guān)于西北寒燥證證候動物模型建立的思考［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（1）：16.

［10］阿地里江·阿布力米提，哈木拉提·吾甫爾.異質(zhì)維醫(yī)異常黑膽質(zhì)證的干寒環(huán)境因素小鼠生物表征的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，15（7）：498.

［11］張軍平，許穎智，李良，等.實驗性動脈粥樣硬化模型復(fù)合建模的方法及評價［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（1）：40-45.

［12］吳開云，高攝淵，袁融，等.維生素D誘發(fā)大鼠動脈粥樣硬化的實驗研究［J］.解剖學(xué)報，1996，27（2）：133-135.

Study on Animal Model of Xinjiang Coronary Heart Disease with Phlegm-turbidity Syndrome

WANG Xin-yu，YANG Jian，AN Dong-qing. TCM College of Xinjiang Medical University，Xinjiang，Wulumuqi 830011，China

Objective：To establish animal model of Xinjiang coronary heart disease with phlegm-turbidity syndrome by combined treatment of artificial climate chamber，high-fat diet，abdominal injection of vitamin D3，and to explore animal model conditions by biopsy and serum index.M ethods：By RCT principle，20 SD rats were divided into normal control group and phlegm-turbidity syndrome group，10 rats in each group.Normal control group was fed the basis diet；phlegm-turbidity syndrome group was fed the high-fat diet，injected with vitamin D3，and fixed 11 hours a day in the artificial climate chamber of cold dry conditions.13 weeks later，tissue sections of aortic renal artery branch to iliac artery and liver were checked.Then weight，total cholesterol in serum，triglycerides，high-density lipoprotein cholesterol，low-density lipoprotein cholesterol，extremely low density lipoprotein cholesterol，interleukin-6in serum，and tumor necrosis factor-α were measured.Result：Compared with normal control group，body weight，total cholesterol in serum，low-density lipoprotein cholesterol，extremely low density lipoprotein cholesterol，serum interleukin-6，and tumor necrosis factor-α in model group had statistical differences （P＜0.05）.In aspects of triglycerides and high-density lipoprotein cholesterol，there were no significant differences（P＞0.05）.There were amorphous materials deposited under artery wall intima.Foam-like cells and moderate hepatic steatosis in liver tissue periphery were observed.Conclusions：Animal model demonstrates the basic clinical characters of Xinjiang coronary heart disease with phlegm-turbidity syndrome so modeling method is initially speculated of certain feasibility.

Animal model of coronary heart disease with phlegm-turbidity syndrome；Lipids；Tissue sections；IL-6；TNF-α

△通信作者

R285.5

A

1004-745X（2014）04-0585-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.009

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2010211A24）；新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實驗室開放課題（XJDX0910-2009-04）

2013-12-25）