胡小東，馬信文

（攀枝花市第二人民醫(yī)院骨科，四川 攀枝花 617028）

·論著·

骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中骨橋蛋白的表達(dá)調(diào)控研究

胡小東，馬信文

（攀枝花市第二人民醫(yī)院骨科，四川 攀枝花 617028）

目的檢測骨關(guān)節(jié)炎(OA)患者骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)，探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路對OPN的表達(dá)調(diào)控作用。方法分離OA患者(骨關(guān)節(jié)炎組12例)的軟骨細(xì)胞，并取非OA患者軟骨細(xì)胞作為正常對照(8例)，熒光定量PCR檢測OPN基因的表達(dá)；基因轉(zhuǎn)染雙鏈siRNA干擾β-catenin基因的表達(dá)；Western blot實(shí)驗(yàn)檢測β-catenin和OPN蛋白的表達(dá)改變。結(jié)果骨關(guān)節(jié)炎組和正常對照組軟骨細(xì)胞OPN的mRNA表達(dá)量分別為(0.642±0.155)和(0.226±0.077)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.74，P＜0.01)。特異性靶向雙鏈siRNA可以下調(diào)β-catenin的表達(dá)，Western blot檢測顯示下調(diào)β-catenin蛋白的表達(dá)后軟骨細(xì)胞OPN蛋白的表達(dá)也出現(xiàn)了相應(yīng)的下調(diào)。結(jié)論骨關(guān)節(jié)炎患者中存在骨橋蛋白的表達(dá)上調(diào)，骨橋蛋白的上調(diào)受到Wnt/β-catenin通路的調(diào)控。

骨關(guān)節(jié)炎；骨橋蛋白；Wnt/β-catenin信號(hào)通路

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)又稱退化性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)病或骨關(guān)節(jié)病，是一組關(guān)節(jié)軟骨或軟骨下降解的機(jī)械異常性疾病，骨關(guān)節(jié)炎是一個(gè)常見的老年性骨科慢性疾病。80%的65歲以上的老人都會(huì)有骨關(guān)節(jié)的影像學(xué)改變，大約60%的老人會(huì)有臨床癥狀，流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示近年來骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有逐年增加的趨勢[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍不清楚，最近的研究顯示骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)在關(guān)節(jié)軟骨的退行性變中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，可以誘發(fā)OA的發(fā)生[3-4]。本研究觀察了骨關(guān)節(jié)炎患者骨橋蛋白表達(dá)的異常，并探討了Wnt/β-catenin信號(hào)通路對OPN的表達(dá)調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 病例選擇選取2012-2013年人工關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患者12例，其中男性4例，女性8例，年齡56～71歲，平均(61.5±9.4)歲，骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)修定的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南》[5]，術(shù)中在軟骨退變區(qū)削取軟骨標(biāo)本。另取本院因外傷手術(shù)時(shí)的游離軟骨8例作為正常對照，排除骨性關(guān)節(jié)炎患者。其中男性3例，女性5例，年齡51～72歲，平均(63.4±9.2)歲，兩組樣本在性別、年齡等一般臨床資料方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 試劑DMEM培養(yǎng)基購自杭州四季青生物工程材料有限公司，Trizol、RT-PCR試劑盒、SYBR Green熒光定量檢測試劑盒購自美國基因公司，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)siRNA干擾試劑盒購自上海吉瑪生物科技有限公司，Ⅱ型膠原酶β-catenin、OPN、內(nèi)參和二抗為美國R.D公司產(chǎn)品。

1.3 單細(xì)胞的制備和培養(yǎng)按照Matsui等[6]的方法分離軟骨細(xì)胞，簡述如下：分離的軟骨剪碎，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶37℃，水浴消化6～8 h，吹打細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，軟骨細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中。采用RT-PCR方法檢測Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)水平來鑒定軟骨細(xì)胞。

1.4 熒光定量PCR嚴(yán)格按照Trizol和RT-PCR試劑盒說明書操作提取分離的軟骨細(xì)胞RNA，并同時(shí)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，按照熒光定量PCR檢測試劑盒說明書操作，PCR反應(yīng)管加入上下游引物，OPN：上游：5'-CCTTCCAACGATCTCTTACTACTTGG-3'下游：5'-ACTGGAAGCAAGAGGGGATG-3'；β-actin：上游：5'-AGTGTGTGAAGAAGGGTCG-3'，下游：5'-GGCAGTGATGGCATGGAACATA-3'，儀器為美國ABI公司Prism7500熒光定量PCR儀，程序設(shè)定為：95℃1 min；95℃15 s，60℃15 s，72℃20 s，35個(gè)循環(huán)?！鰿t值=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，目的基因的表達(dá)量采用2-△Ct評(píng)估。

1.5 基因沉默分離的OA患者軟骨細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞達(dá)到60%～80%融合時(shí)，實(shí)驗(yàn)分為對照(A)組、特異性RNA干擾(B)組、陰性RNA干擾對照(C)組，按照β-catenin RNA干擾試劑盒說明書使用Lipofectin 2000轉(zhuǎn)染小分子雙鏈RNA干擾序列。β-catenin干擾序列為5'-AGCGCUUGGAGCUCGAGAAdTdT-3'(正義鏈)，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測β-catenin基因沉默的效果。

1.6 Western blot1×SDS上樣緩沖液裂解上述處理的軟骨細(xì)胞，取50 μg蛋白SDS-PAGE膠電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，按照抗體試劑盒說明書操作加入稀釋的特異性一抗孵育PVDF膜，4°C過夜，二抗室溫1 h，使用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，暗室X-ray曝光，1 min后顯示目的條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞骨橋蛋白表達(dá)的改變骨關(guān)節(jié)炎組和正常對照組軟骨細(xì)胞骨橋蛋白的mRNA表達(dá)量(2-△Ct值)分別為(0.642±0.155)和0.226± 0.077，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.74，P＜0.01)，見圖1。

圖1 骨橋蛋白mRNA表達(dá)的熒光定量PCR檢測

2.2 β-catenin siRNA對骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞骨橋蛋白表達(dá)的抑制作用從圖2可見特異性靶向雙鏈siRNA下調(diào)了β-catenin的表達(dá)，而陰性對照siRNA對β-catenin的表達(dá)水平?jīng)]有顯著的影響，說明本研究所用的雙鏈β-catenin siRNA能夠有效抑制β-catenin的表達(dá)。靶向β-catenin雙鏈siRNA干擾骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞48 h后，在下調(diào)β-catenin的同時(shí)也降低了軟骨細(xì)胞OPN蛋白的表達(dá)，說明β-catenin調(diào)控了OPN蛋白的表達(dá)，見圖2。

圖2 RNA干擾β-catenin后Western blot檢測β-catenin和OPN蛋白

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎(OA)的發(fā)病率約占總?cè)丝诘?0%左右，一般隨著年齡的增長OA的患病率會(huì)逐漸增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，50歲以上人群OA的發(fā)病率可達(dá)到50%，55歲以上發(fā)病率甚至可達(dá)到80%，軟骨細(xì)胞的代謝異常和退行性變是OA的主要病理改變[7]，但是其具體的發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，因此探討軟骨細(xì)胞退行性變的機(jī)制將會(huì)為OA的防治提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種多功能的磷酸化糖蛋白，通過與單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)過程，例如免疫反應(yīng)、血管生成、軟骨內(nèi)化骨、細(xì)胞再生、骨質(zhì)疏松病變的起始等。OPN可以通過增強(qiáng)IL-12和抑制IL-10活性調(diào)節(jié)Th1 T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)來參與炎癥反應(yīng)，有研究顯示OPN是OA中最早出現(xiàn)也是最主要的病理改變，OPN可以通過上調(diào)MMP-13和減少組織中的蛋白多糖致軟骨的退行性變，還可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡破壞關(guān)節(jié)軟骨[8-9]，本研究的結(jié)果也顯示了OA患者軟骨細(xì)胞中OPN的表達(dá)顯著高于正常對照。

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)蛋白是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，Wnt/β-catenin通路激活時(shí)可使β-catenin蛋白游離出來計(jì)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。已有研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin通路在保持關(guān)節(jié)完整性方面起著重要作用，例如在β-catenin轉(zhuǎn)基因的小鼠中可發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)骨贅的形成，同時(shí)軟骨下有新的編織骨和關(guān)節(jié)軟骨全層缺失[10-11]。本研究使用靶向β-catenin的siRNA沉默β-catenin基因的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)OPN蛋白也出現(xiàn)相應(yīng)的降低，提示了β-catenin對OPN具有一定的調(diào)控作用，可能的機(jī)制是激活的β-catenin入核結(jié)合到OPN啟動(dòng)子的上游調(diào)控元件增強(qiáng)了OPN的表達(dá)。

總之，本研究顯示骨關(guān)節(jié)炎患者中出現(xiàn)了骨橋蛋白的表達(dá)上調(diào)，骨橋蛋白的上調(diào)受到Wnt/β-catenin通路的調(diào)控。

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Regulation mechanism of osteopontin expression in osteoarthritis.

HU Xiao-dong,MA Xin-wen.Department of Orthopedics,the Second People's Hospital of Panzhihua City,Panzhihua 617028,Sichuan,CHINA.

ObjectiveTo detect the expression of osteopontin(OPN)in osteoarthritis(OA)patients,and explore the regulation mechanism of OPN by Wnt/β-catenin signaling pathway.MethodsThe chondrocytes were separated from OA patients(12 cases as OA group)and non-OA patients(8 cases as control group).The mRNA expression of OPN was determined by real-time PCR analysis.The small interfering RNA was used to specifically knockdown β-catenin in chondrocytes.And then the expression of β-catenin and OPN protein were detected by Western blot.ResultsThe 2-△Ctvalues of OPN mRNA were(0.226±0.077)and(0.642±0.155)in control and OA group,respectively.There was significant difference between the two groups(t=6.74，P＜0.01).The expression of β-catenin was significantly and specifically down-regulated by siRNA duplexes and a corresponding down-regulation was also detected in OPN protein expression by Western blot.ConclusionThere is an up-regulated expression of OPN in osteoarthritis patients,which is mediated by Wnt/β-catenin signaling pathway.

Osteoarthritis(OA);Osteopontin(OPN);Wnt/β-catenin pathway

R684.3

A

1003—6350（2014）13—1877—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.13.0730

2013-12-25)

胡小東。E-mail：hdxong@163.com