齊向云，李康，夏燕平，楊靜，戴岳

1.中國(guó)藥科大學(xué) 中藥藥理教研室，江蘇 南京 211198；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；3.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124；4.河南中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 鄭州 450008

腸道病毒71型（enterovirus type 71，EV71）屬小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（En?terovirus），是單股正鏈RNA病毒[1]。該病毒是引起手足口?。╤and-foot-mouth disease，HFMD）的病原體之一，與其他能引起HFMD的病毒的不同之處在于EV71具有嗜神經(jīng)毒性，易引起無(wú)菌性腦炎、腦膜腦炎、心肌炎等并發(fā)癥，且易導(dǎo)致患兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩和認(rèn)知功能減退[2-3]。EV71顆粒呈球形，直徑24～30 nm，無(wú)包膜和突起，衣殼為正20面體對(duì)稱，由60個(gè)相同的亞單位構(gòu)成，每個(gè)亞單位包含VP1～VP4等4種衣殼蛋白，其中VP1～VP3暴露在病毒顆粒表面，VP4包埋在衣殼內(nèi)側(cè)，與RNA核心緊密連接[4]。目前認(rèn)為EV71的復(fù)制機(jī)制與脊髓灰質(zhì)炎病毒（poli?onyelitis virus，PV）高度相似[5]。由于宿主細(xì)胞內(nèi)缺乏EV71基因組復(fù)制必需的酶，病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后不能立刻開(kāi)始基因組的復(fù)制，而是先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。首先，EV71與細(xì)胞膜受體結(jié)合后，病毒顆?？臻g構(gòu)象發(fā)生改變而丟失VP4，同時(shí)使宿主細(xì)胞膜穿孔，最終病毒脫去外殼并釋放病毒核酸進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，開(kāi)始病毒多肽的翻譯[6-7]。EV71基因組RNA可直接被靶細(xì)胞的多核糖體翻譯，首先直接翻譯出一個(gè)多聚蛋白（2193個(gè)氨基酸殘基），多聚蛋白在合成時(shí)又被自身水解產(chǎn)生的蛋白酶切割成前體蛋白（P1、P2和P3），前體蛋白再經(jīng)加工形成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4），以及具有不同酶活性、特殊功能及未知功能的非結(jié)構(gòu)蛋白（3C或3CD、3AB或3A和3B、3D，以及2A、2B和2C）。其中非結(jié)構(gòu)蛋白3D形成RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA poly?merase，RdRp）。隨后，RNA模板在RdRp的作用下合成負(fù)鏈RNA，再以負(fù)鏈RNA為模板在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)一步合成大量正鏈RNA，隨著大量病毒正鏈RNA在細(xì)胞漿內(nèi)的堆積，子代病毒顆粒開(kāi)始組裝[8]。EV71在宿主細(xì)胞中繁殖和復(fù)制的同時(shí)，還抑制宿主細(xì)胞DNA修復(fù)和蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)宿主細(xì)胞的凋亡[7]。EV71在不同細(xì)胞中的增殖動(dòng)力學(xué)研究，對(duì)抗EV71藥物作用機(jī)制研究等具有一定的指導(dǎo)作用。其中EV71在RD細(xì)胞中的增殖動(dòng)力學(xué)已有比較系統(tǒng)的研究[9]，但依舊缺乏噬斑方面的數(shù)據(jù)，而EV71在Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)力學(xué)研究還未見(jiàn)報(bào)道。

病毒噬斑又稱蝕斑，是病毒在已長(zhǎng)成的單層細(xì)胞上形成的局限性病灶，一個(gè)噬斑為一個(gè)病毒體的繁殖后代品系。噬斑試驗(yàn)是一種可較精確地測(cè)定病毒感染力的方法[10]。在此，我們對(duì)比討論了培養(yǎng)基類(lèi)型、羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、胎牛血清（FBS）、牛血清白蛋白（BSA）及甲基纖維素（MC）濃度對(duì)EV71噬斑形成的影響，進(jìn)一步利用最適營(yíng)養(yǎng)覆蓋物配比進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)，比較了EV71在RD細(xì)胞和Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)力學(xué)特征，為研究EV71感染復(fù)制機(jī)制及抗EV71藥物研究提供參考和支持。

1 材料與方法

1.1 材料

EV71為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)BrCr株，由解放軍302醫(yī)院貌盼勇教授惠贈(zèng)，-70℃保存；人胚胎橫紋肌肉瘤（RD）細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，用含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；非洲綠猴腎（Vero）細(xì)胞由中國(guó)藥品生物制品檢定所贈(zèng)送，用含10%FBS、1%雙抗的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2貼壁培養(yǎng)，3 d傳代1次。

HEPES緩沖液（1 mol/L）、雙抗（青霉素1×104U/mL，鏈霉素1×104μg/mL）、MEM和DMEM培養(yǎng)液均購(gòu)自邁晨生物科技公司；FBS為Hyclone公司產(chǎn)品；0.25% 胰酶-EDTA、MEM和DMEM干粉為GIB?CO公司產(chǎn)品；MC為Sigma公司產(chǎn)品；RIPA裂解液購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱、生物安全柜、-70℃冰箱、超凈工作臺(tái)均為T(mén)hermo Forma公司產(chǎn)品；Mili-Q超純水系統(tǒng)為MILIIPORE公司產(chǎn)品；Typhoon 9410掃描儀為Amersham公司產(chǎn)品；制冰機(jī)為SANYO公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 甲基纖維素營(yíng)養(yǎng)覆蓋物的配制

MC覆蓋物：2×培養(yǎng)液與2%MC溶液按1∶1混合（其余成分如FBS、HEPES和雙抗等按照需要量預(yù)先溶解到2×培養(yǎng)液中），用力搖勻，靜置數(shù)小時(shí)后分裝，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2×培養(yǎng)液：MEM干粉9.6 g用500 mL高壓過(guò)的Mili-Q超純水溶解，加入NaHCO3粉末2 g溶解完全，再用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值為7.0～7.2，用0.2 μm濾器過(guò)濾，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2%MC溶液：4 g MC粉末用200 mL熱的Mi?li-Q超純水（75～100℃）分散后，室溫持續(xù)攪拌至液體成透明的均勻黏稠物，高壓滅菌，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 噬斑實(shí)驗(yàn)

Vero細(xì)胞以3.5×105/孔接種到 12孔板，次日待細(xì)胞長(zhǎng)至致密單層，用病毒稀釋液以400 μL/孔感染Vero細(xì)胞，于37℃、5%CO2條件下孵育1 h，吸棄病毒稀釋液，用PBS洗2次，加入MC營(yíng)養(yǎng)覆蓋物，37℃、5%CO2孵育，每日觀察噬斑情況，待噬斑明顯且不再增多時(shí)（第4 d），用4%甲醛溶液固定，用1%結(jié)晶紫溶液染色，計(jì)數(shù)。噬斑形成單位（PFU/mL）=噬斑數(shù)×病毒稀釋度×1 mL/400 μL。

1.4 EV71在RD和Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)力學(xué)特征

病毒以MOI=0.1分別接種RD細(xì)胞和Vero細(xì)胞，37℃、5%CO2孵育1 h后吸棄病毒液，PBS洗2次，加入含2%FBS的培養(yǎng)液于37℃、5%CO2條件下孵育，分別于接種后3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60和72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)液（RD細(xì)胞收集到接種后第48 h），噬斑法分別計(jì)算病毒滴度。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包處理，數(shù)值變量采用x±s進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液中病毒滴度用噬斑形成單位（PFU/mL）表示，病毒滴度取以2為底的對(duì)數(shù)后與所對(duì)應(yīng)的時(shí)間作圖[9]進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基規(guī)格及FBS含量對(duì)噬斑形成的影響

不同規(guī)格（1×或2×）的MEM或DMEM培養(yǎng)液與2%MC溶液對(duì)比混合均勻配制成營(yíng)養(yǎng)覆蓋物，含終濃度為1%的雙抗、10 mmol/L的HEPES緩沖液和2%（或10%）的FBS。病毒稀釋至1/104后感染12孔板中的Vero細(xì)胞單層進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，DMEM（1×）和MEM（1×）與2%MC對(duì)半混合配制成的營(yíng)養(yǎng)覆蓋物，終濃度含2%或10%FBS均不能形成噬斑；DMEM（2×）和MEM（2×）與2%MC對(duì)半混合配制成的營(yíng)養(yǎng)覆蓋物，含2%FBS可以形成噬斑。

2.2 營(yíng)養(yǎng)覆蓋物中HEPES緩沖液、FBS和BSA對(duì)噬斑形成的影響

圖1 培養(yǎng)基規(guī)格及FBS含量對(duì)噬斑形成的影響（100×）

2×培養(yǎng)液與2%MC對(duì)半混合均勻，配制成終濃度含有或不含HEPES緩沖液（10 mmol/L）、2%FBS和0.2%BSA的營(yíng)養(yǎng)覆蓋物。病毒稀釋至1/104后感染12孔板中的Vero細(xì)胞單層，用含不同成分的營(yíng)養(yǎng)覆蓋物進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，終濃度含2%FBS的覆蓋物，病毒滴度（PFU/mL）取對(duì)數(shù)后為（5.53±0.02），終濃度不含F(xiàn)BS的營(yíng)養(yǎng)覆蓋，病毒滴度取對(duì)數(shù)后為（3.76±0.06），含血清與不含血清存在顯著性差異（P＜0.001）；覆蓋物中加入HEPES緩沖液與BSA不能顯著增加噬斑形成單位（P＞0.05）（圖2）。

2.3 MC溶液濃度對(duì)噬斑形成的影響

2×培養(yǎng)液分別與不同濃度MC溶液對(duì)半混合均勻，配制成營(yíng)養(yǎng)覆蓋物，終濃度含10 mmol/L HEPES緩沖液、1%雙抗，2%FBS。EV71分別稀釋至1/103、1/104和1/105后感染12孔板中的Vero細(xì)胞單層，分別用終濃度含0.5%、0.8%、1%或1.2%的MC的營(yíng)養(yǎng)覆蓋物進(jìn)行噬斑實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒稀釋度為1/104和1/105時(shí)，含1%MC的營(yíng)養(yǎng)覆蓋物出斑最多，含 0.8%MC的覆蓋物次之；其中含1.2%MC的營(yíng)養(yǎng)覆蓋物的噬斑直徑最?。▓D3）。

2.4 EV71在RD和Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)力學(xué)特征

鏡下觀察，RD細(xì)胞在接種EV71 48 h內(nèi)細(xì)胞即可完全凋亡，Vero細(xì)胞在接種病毒60 h后全部凋亡。噬斑實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，EV71接種RD細(xì)胞或Vero細(xì)胞12、24、48（和60）h后病毒滴度分別出現(xiàn)一個(gè)陡升。其中，RD細(xì)胞在接種EV71后第3 h病毒滴度即開(kāi)始升高，且迅速進(jìn)入指數(shù)增加階段，12 h后病毒滴度增加約256倍，此時(shí)鏡下觀察RD細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，12 h后病毒滴度增殖速度逐漸下降，直到RD細(xì)胞全部凋亡（約48 h），測(cè)得病毒滴度增加262 144倍。而在Vero細(xì)胞中，EV71的增殖曲線比較溫和，接種細(xì)胞后第3～6 h病毒滴度升高得比較緩慢，在接種后9～12 h開(kāi)始呈指數(shù)增高，12 h后病毒滴度增加約16倍；接種EV71后第12～24 h，病毒滴度的變化與前12 h情況相似，24 h測(cè)定的EV71滴度較第12 h增加約12倍，此后Vero細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生明顯的病變及凋亡，病毒增殖速度逐漸下降，第60 h后病毒滴度達(dá)到平臺(tái)期，最終，病毒滴度增加2048倍（圖4）。

圖2 營(yíng)養(yǎng)覆蓋物中加入FBS、HEPES和BSA對(duì)噬斑形成的影響（x±s，n=3）

圖3 MC溶液濃度對(duì)噬斑形成的影響

圖4 EV71在RD細(xì)胞和Vero細(xì)胞中的增殖動(dòng)力學(xué)（x±s，n=3）

3 討論

細(xì)胞密度及生長(zhǎng)狀態(tài)是噬斑形成的關(guān)鍵因素之一，細(xì)胞生長(zhǎng)密度過(guò)高或狀態(tài)不好，容易凋亡、脫落，細(xì)胞密度過(guò)低亦不宜形成噬斑。血清質(zhì)量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝速度及生長(zhǎng)狀態(tài)的影響較大，繼而影響噬斑形成單位及形成周期。因此，為保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，應(yīng)盡量使用同一類(lèi)型相同批號(hào)的血清。在病毒噬斑形成實(shí)驗(yàn)中，BSA對(duì)含血清營(yíng)養(yǎng)覆蓋物而言為非必需成分。另外，不同直徑的病毒顆粒對(duì)MC濃度的要求不同，濃度太高或太低都會(huì)減少噬斑數(shù)，且MC密度越大，噬斑直徑越小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EV71在RD細(xì)胞和Vero細(xì)胞內(nèi)增殖周期均約為12 h，這與文獻(xiàn)[9]關(guān)于EV71在RD細(xì)胞內(nèi)增殖周期的報(bào)道相符。其中，EV71在RD細(xì)胞中的增殖代謝活動(dòng)比較活躍，在接種后第3～6 h即有大量病毒顆粒釋放出細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)液，在第1個(gè)增殖周期（約12 h）完成后病毒滴度增加約256倍，此時(shí)RD細(xì)胞即出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），48 h以內(nèi)細(xì)胞即完全凋亡。而EV71在Vero細(xì)胞中的增殖曲線相對(duì)較平緩?？傊?，在相同病毒感染復(fù)數(shù)情況下，EV71在RD細(xì)胞中的增殖活動(dòng)較Vero細(xì)胞中活躍，增殖效率高。EV71在RD細(xì)胞和Vero細(xì)胞中增殖曲線的繪制，為研究EV71感染復(fù)制機(jī)制及抗病毒藥物研究提供了參考。

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