劉中洋，劉艷，襲榮剛，王曉波

1.沈陽軍區(qū) 藥物研究所，遼寧 大連 116015；2.解放軍第210醫(yī)院，遼寧 大連 116015

含纈酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）是與多種細(xì)胞活性相關(guān)的三磷酸腺苷酶超家族（ATPases associated with various cellular activities，AAA）中的一員，是糖基磷脂酰肌醇連接的轉(zhuǎn)鐵蛋白同系物，又稱黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白或p97，參與核酸的重建、膜損傷、細(xì)胞周期調(diào)控等重要細(xì)胞活動，具有激活NFκB、抗細(xì)胞凋亡、啟動轉(zhuǎn)錄因子及促進(jìn)細(xì)胞增殖、浸潤等作用[1-2]。

p97蛋白在許多泛素化依賴的過程中扮演著中心分子的角色[3-4]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）相關(guān)的降解過程中的p97分子功能研究得最清楚[5]。ER中錯誤折疊的蛋白被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜的胞質(zhì)側(cè)，并在此進(jìn)行泛素化修飾。p97與其輔因子UFD1-NPL4形成復(fù)合物，之后與泛素化蛋白結(jié)合，并且將它們從質(zhì)膜上提取出來以促進(jìn)其向蛋白酶體的傳送。同樣，p97-UFD1-NPL4復(fù)合物也介導(dǎo)多聚泛素蛋白從染色質(zhì)中分離出來，在某些情況下這些蛋白也被轉(zhuǎn)移至蛋白酶體[5-6]。在調(diào)控轉(zhuǎn)錄、DNA損傷應(yīng)答及細(xì)胞周期過程中，p97-Ufd1-Npl4的染色質(zhì)相關(guān)活性至關(guān)重要，是維持增殖細(xì)胞基因穩(wěn)定性的必需物[7-8]。

除了p97-UFD1-NPL4之外，p97還能與具有其他細(xì)胞功能的輔因子形成復(fù)合物[5,9]。這些輔因子大都含有UBX或UBX樣的泛素化折疊結(jié)構(gòu)域，可調(diào)節(jié)其與p97蛋白的結(jié)合[10]。p97與含有UBX結(jié)構(gòu)域（包括p47或其同源物p37）結(jié)合成復(fù)合物，指導(dǎo)有絲分裂和調(diào)控高爾基體的改造[11]。p97-p47依賴的反應(yīng)是泛素依賴性的，并且需要p47的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和去泛素化酶VCIP135的存在[12]。雖然迄今泛素化的靶標(biāo)仍未確定，但依然表明p97在這些過程中“管理”著一個重要的調(diào)控步驟[13]。此外，近年來許多研究將p97與膜介導(dǎo)的胞內(nèi)運輸和自噬聯(lián)系在一起。有趣的是，這2條途徑不是通過蛋白酶體而是通過向溶酶體運送物質(zhì)進(jìn)行降解。

1 胞內(nèi)運輸及其泛素化調(diào)控

細(xì)胞的內(nèi)吞作用受許多不同機制的調(diào)控[14-15]。細(xì)胞外的物質(zhì)和部分質(zhì)膜蛋白被攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)小泡進(jìn)而形成早期的胞內(nèi)體，之后膜蛋白或者被質(zhì)膜回收再利用，或者被運送至晚期的胞內(nèi)體和溶酶體進(jìn)行降解[16]。目前，研究最深的是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[17]。以復(fù)雜的信號傳遞事件開始，可溶的成分（包括網(wǎng)格蛋白）在細(xì)胞膜的胞質(zhì)側(cè)形成一個膜外套以及集中要運輸?shù)摹柏浳铩?。此外，還有窖蛋白（caveolin，Cav）-1及Cav-1的同系物介導(dǎo)的胞內(nèi)運輸[18-19]。與網(wǎng)格蛋白相反，Cav-1是一種具有能夠插入質(zhì)膜的胞質(zhì)小葉的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)膜蛋白，細(xì)胞膜內(nèi)陷形成胞膜窖（caveolae）。

研究表明，內(nèi)吞小泡融合形成早期的胞內(nèi)體是受小GTP酶Rab5和它的效應(yīng)器，如早期胞內(nèi)抗原（EEA1）調(diào)控的[20-21]。招募的分子運至胞內(nèi)體膜后，能夠與Rab5效應(yīng)蛋白、Rabaptin-5、Rabex-5及膜融合因子NSF裝配成大分子復(fù)合物[22]。Rab5也能招募磷脂酰肌醇-3激酶Vps34/p150，從而標(biāo)記早期的胞內(nèi)體。在成熟至晚期的胞內(nèi)體過程中，Rab5被Rab7替換[16]。

轉(zhuǎn)運必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物（endosomal sort?ing complex required for transport，ESCRT）是指一系列的四蛋白復(fù)合物（ESCRT-0至ESCRT-Ⅲ），跨膜蛋白從胞內(nèi)體向溶酶體的選擇性運輸過程受ES?CRT蛋白復(fù)合物調(diào)節(jié)[23-24]。ESCRT復(fù)合物的連續(xù)能夠激活調(diào)節(jié)綁定物質(zhì)的濃度、胞內(nèi)小泡的形成以及將物質(zhì)分揀至這些小泡，最后ESCRT復(fù)合物組分ATP酶超家族的VPS4回收再利用[25-26]。胞內(nèi)體膜結(jié)合之后形成的細(xì)胞器，也就是我們所說的多泡體，在細(xì)胞核的周圍與溶酶體融合之后，囊泡的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組分被酸性水解酶降解[27]。其中糖蛋白LAMP1仍然留在膜上，成為晚期胞內(nèi)體或溶酶體的標(biāo)記物。

不管是內(nèi)吞作用還是多泡體的形成都涉及高度調(diào)控及蛋白質(zhì)相互作用。以單泛素、多泛素或短賴氨酸63連接的多聚泛肽鏈等形式的泛素修飾，在物質(zhì)分選和調(diào)控分選機器中扮演重要角色[28]。在質(zhì)膜上物質(zhì)的泛素化起內(nèi)化信號（如epsin或EPS15）的作用。然而，分選機器的組分包括epsin本身也被泛素化，進(jìn)而參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用[29]?？傊?，泛素化的動態(tài)性和泛素管理的相互作用網(wǎng)絡(luò)受到特殊的泛素連接酶和去泛素化酶的調(diào)控[30]。

2 VCP/p97在胞吞途徑中的作用

上世紀(jì)90年代，Pleasure等首次發(fā)現(xiàn)p97參與內(nèi)吞作用，并與內(nèi)吞小泡膜組件蛋白相互作用[31]。然而，p97對內(nèi)吞作用功能性的影響及其與內(nèi)吞轉(zhuǎn)運的關(guān)系仍待進(jìn)一步的研究。2011年，Ramanathan和Ritz分別在自己的研究中揭示了p97與內(nèi)吞作用的新聯(lián)系，又一次證明了p97與胞吞途徑的組分發(fā)生物理作用[32-33]。

p97在胞吞途徑的一些步驟中扮演著什么樣的角色？它的功能是什么？已證明在各種途徑中p97能夠提取泛素修飾的靶蛋白[3-4]；相反，泛素化廣泛參與胞吞途徑不但擔(dān)任著“貨物”蛋白分選信號的功能，還調(diào)節(jié)著內(nèi)吞機器的活性和相互作用[28]。同樣，Carvalho等認(rèn)為p97可能不僅在ER相關(guān)的降解過程中直接綁定和提取泛素化底物，而且還可能在結(jié)構(gòu)上改造運輸機器以提高底物的運輸效率[34]。然而迄今的研究數(shù)據(jù)表明，p97在胞內(nèi)體中的作用是非蛋白酶體依賴性的，但并不完全排除蛋白酶體的參與。也有報道稱交叉遞呈過程中，胞內(nèi)體中底物多聚泛素化會招募p97，將底物提取出來運送至蛋白酶體，并在此進(jìn)行抗原遞呈處理[35]。

此外，p97參與胞內(nèi)運輸也有醫(yī)學(xué)相關(guān)性。p97點突變造成顯性遺傳累及多系統(tǒng)的退行性疾病，稱為包涵體肌病與Paget骨和額顳癡呆（inclusion body myopathy with Paget's disease of bone and fronto-temporal dementia，IBMPFD）[36-37]。值得注意的是，疾病相關(guān)的突變特異性地廢除了p97與其輔因子如UBXD1的相互作用，但對UFD1-NPL4或p47無效[33,38]，同時也影響了Cav-1的綁定[33]。這表明，細(xì)胞內(nèi)吞作用缺陷可能有助于該疾病發(fā)病機理的研究。同時，雖然ER相關(guān)的降解并沒有受損，但自噬也受到疾病相關(guān)的p97突變的影響[32,39]。提示p97與自噬的功能和胞內(nèi)運輸有一定的聯(lián)系。

3 自噬中的VCP與胞內(nèi)運輸潛在的聯(lián)系

自噬是降解大分子結(jié)構(gòu)如細(xì)胞器和蛋白聚集物的過程。自噬起始于雙層膜的形成，該雙層膜是由泛素樣蛋白LC3（LC3-Ⅱ）的脂類形式標(biāo)記，之后吞噬細(xì)胞組分形成自噬體。根據(jù)降解的物質(zhì)不同，可將自噬分為大自噬、核糖體自噬、線粒體自噬及微自噬[40-43]。在許多情況下要降解的物質(zhì)與泛素結(jié)合，在自噬體膜上通過特殊的銜接蛋白p62和NBR1與LC3-Ⅱ銜接起來[44]。自噬體最終與溶酶體結(jié)合，對大分子物質(zhì)進(jìn)行降解[45]。

Ju等在p97相關(guān)疾病IBMPFD中首次揭示p97參與自噬過程。他們發(fā)現(xiàn)病人組織切片中富含泛素和自噬標(biāo)志蛋白p62及LC3B的泡狀結(jié)構(gòu)[46]，在表達(dá)疾病相關(guān)的p97轉(zhuǎn)基因小鼠及組織培養(yǎng)的細(xì)胞（p97突變或siRNA干擾p97缺陷）中也得到驗證[47-48]。目前已有許多研究表明p97在自噬中的作用[49]。Weihl等發(fā)現(xiàn)在p97缺乏時自噬體和溶酶體的融合受到抑制[46]；Taylor等發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶D陽性的自噬體中，p97只在自噬體和溶酶體融合之后發(fā)揮作用[39]。與哺乳類動物相比，酵母菌的p97同系物Cdc48及其輔因子Shp1（哺乳動物p47的同系物）是自噬體形成過程中所必需的，同時在自噬過程中Shp1和Atg8（LC3的同系物）可以直接相互作用[50]。此外，在核糖體自噬過程中去泛素化的復(fù)合物UBP3-BRE5通過與p97及其輔因子UFD3形成三重復(fù)合物，從而扮演著十分關(guān)鍵的角色[51]。然而在線粒體自噬過程中可能存在不同的機制。有文獻(xiàn)表明，p97幫助蛋白酶體依賴的線粒體融合蛋白降解[52]。從酵母菌中獲得的數(shù)據(jù)也表明，細(xì)胞核的零碎微自噬需要Cdc48及其輔因子Shp1的存在[53]?？傊?xì)胞核周圍聚集體的形成及聚集蛋白的清除，也是p97的重要功能之一。

4 結(jié)語

越來越多的資料已顯示p97參與了胞內(nèi)運輸和自噬，現(xiàn)在最重要的是理解在這些細(xì)胞過程中p97的基礎(chǔ)分子機制。此外，p97可能參與形成更大的功能復(fù)合物，諸如膜錨定的招募因子、泛素連接酶、去泛素化酶等。對p97更深入的研究分析將有助于理解這些細(xì)胞進(jìn)程。

[1]Dai R M,Li C C.Valosin-containing protein is a multi-ubiq?uitin chain-targeting factor required in ubiquitin-proteasome degradation[J].Nat Cell Biol,2001,3(8):740-744.

[2]Dai R M,Chen E,Longo D L,et al.Involvement of valosincontaining protein，an ATPase co-purified with IkappaBatpha and 26S proteasome，in ubiquitin-proteasome-mediated degra?dation of IkappaBalpha[J].J Biol Chem,1998,273(6):3562-3573.

[3]Meyer H,Bug M,Bremer S.Emerging functions of the VCP/p97 AAA ATPase in the ubiquitin system[J].Nat Cell Biol,2012,14(2):117-123.

[4]Ye Y.Diverse functions with a common regulator:ubiquitin takes command of an AAA ATPase[J].J Struct Biol,2006,156(1):29-40.

[5]Stolz A,Hilt W,Buchberger A,et al.Cdc48:a power ma?chine in protein degradation[J].Trends Biochem,Sci,2011,36(10):515-523.

[6]Yamanaka K,Sasagawa Y,Ogura T.Recent advances in p97/VCP/Cdc48 cellular functions[J].Biochim Biophys Acta,2012,1823(1):130-137.

[7]Chapman E,Fry A N,Kang M.The complexities of p97 func?tion in healthand disease[J].Mol Biosyst,2011,7(3):700-710.

[8]Haines D S.P97-containing complexes in proliferation control and cancer:emerging culprits or guilt by association[J]?Genes Cancer,2010,1(7):753-763.

[9]Alexandru G,Graumann J,Smith G T,et al.UBXD7 binds multiple ubiquitin ligases and implicates p97 in HIF1alpha turnover[J].Cell,2008,134(5):804-816.

[10]Schuberth C,Buchberger A.UBX domain proteins:major regu?lators of the AAA ATPase Cdc48/p97[J].Cell Mol Life Sci,2008,65(15):2360-2371.

[11]Uchiyama K,Kondo H.P97/p47-mediated biogenesis of Golgi and ER[J].J Biochem(Tokyo),2005,137(2):115-119.

[12]Wang Y,Satoh A,Warren G,et al.VCIP135 acts as a deu?biquitinating enzyme during p97-p47-mediated reassembly of mitotic Golgi fragments[J].J Cell Biol,2004,164(7):973-978.

[13]Meyer H H.Golgi reassembly after mitosis:the AAA family meets the ubiquitin family[J].Biochim Biophys Acta,2005,1744(3):481-492.

[14]Doherty G J,McMahon H T.Mechanisms of endocytosis[J].Annu Rev Biochem,2009,78:857-902.

[15]Mercer J,Schelhaas M,Helenius A.Virus entry by endocyto?sis[J].Annu Rev Biochem,2010,79:803-833.

[16]HuotariJ,HeleniusA.Endosomematuration[J].EMBO J,2011,30(17):3481-3500.

[17]McMahon H T,Boucrot E.Molecular mechanism and physio?logical functions of clathrin-mediated endocytosis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2011,12(8):517-533.

[18]Mayor S,Pagano R E.Pathways of clathrin-independent endo?cytosis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(8):603-612.

[19]Parton R G,Simons K.The multiple faces of caveolae[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(3):185-194.

[20]Mills I G,Jones A T,Clague M J.Involvement of the endo?somal autoantigen EEA1 in homotypic fusion of early endo?somes[J].Curr Biol,1998,8(15):881-884.

[21]Zerial M,McBride H.Rab proteins as membrane organizers[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(2):107-117.

[22]McBride H M,Rybin V,Murphy C,et al.Oligomeric com?plexes link Rab5 effectors with NSF and drive membrane fu?sion via interactions between EEA1 and syntaxin 13[J].Cell,1999,98(3):377-386.

[23]Hurley J H,Emr S D.The ESCRT complexes:structure and mechanism of a membrane-trafficking network[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct,2006,35:277-298.

[24]Raiborg C,Stenmark H.The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins[J].Nature,2009,458(7237):445-452.

[25]Gruenberg J,Stenmark H.The biogenesis of multivesicular en?dosomes[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5(4):317-323.

[26]van Meel E,Klumperman J.Imaging and imagination:under?standing the endo-lysosomal system[J].Histochem Cell Biol,2008,129(3):253-266.

[27]Luzio J P,Pryor P R,Bright N A.Lysosomes:fusion and function[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(8):622-632.

[28]Sigismund S,Polo S,Di Fiore P P.Signaling through monou?biquitination[J].Curr Top Microbiol Immunol,2004,286:149-185.

[29]Polo S,Sigismund S,Faretta M,et al.A single motif responsi?ble for ubiquitin recognition and monoubiquitination in endo?cytic proteins[J].Nature,2002,416(6879):451-455.

[30]Clague M J,Urbé S.Endocytosis:the DUB version[J].Trends Cell Biol,2006,16(11):551-559.

[31]Pleasure I T,Black M M,Keen J H.Valosin-containing pro?tein,VCP,is a ubiquitousclathrin-binding protein[J].Nature,1993,365(6445):459-462.

[32]Ramanathan H N,Ye Y.The p97 ATPase associates with EEA1 to regulate the size of early endosomes[J].Cell Res,2012,22(2):346-359.

[33]Ritz D,Vuk M,Kirchner P,et al.Endolysosomal sorting of ubiquitinated caveolin-1 is regulated by VCP/p97 and UBXD1 and impaired by VCP disease mutations[J].Nat Cell Biol,2011,13(9):1116-1123.

[34]Carvalho P,Stanley A M,Rapoport T A.Retrotranslocation of a misfoldedluminal ER protein by the ubiquitin-ligase Hrd1p[J].Cell,2010,143(4):579-591.

[35]Zehner M,Chasan A I,Schuette V,et al.Mannose receptor polyubiquitination regulates endosomal recruitment of p97 and cytosolic antigen translocation for cross-presentation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(24):9933-9938.

[36]Kimonis V E,Fulchiero E,Vesa J,et al.VCP disease associ?ated with myopathy,Paget disease of bone and frontotemporal dementia:review of a unique disorder[J].Biochim Biophys Ac?ta,2008,1782(12):744-748.

[37]Weihl C C,Pestronk A,Kimonis V E.Valosin-containing pro?tein disease:inclusion body myopathy with Paget's disease of the bone and fronto-temporal dementia[J].Neuromuscul Disord,2009,19(5):308-315.

[38]Fernández-Sáiz V,Buchberger A.Imbalances in p97 co-fac?tor interactions in human proteinopathy[J].EMBO Rep,2010,11(6):479-485.

[39]Tresse E,Salomons F A,Vesa J,et al.VCP/p97 is essential formaturation ofubiquitin-containing autophagosomes and this function is impaired by mutations that cause IBMPFD[J].Autophagy,2010,6(2):217-227.

[40]Bernales S,Schuck S,Walter P.ER-phagy:selective autopha?gy of the endoplasmic reticulum[J].Autophagy,2007,3(3):285-287.

[41]Kim I,Rodriguez-Enriquez S,Lemasters J J.Selective degra?dation of mitochondria by mitophagy[J].Arch Biochem Bio?phys,2007,462(2):245-253.

[42]Kraft C,Peter M,Hofmann K.Selective autophagy:ubiquitinmediated recognition and beyond[J].Nat Cell Biol,2010,12(9):836-841.

[43]Kvam E,Goldfarb D S.Nucleus-vacuole junctions and piece?meal microautophagy of the nucleus in S.cerevisiae[J].Au?tophagy,2007,3(2):85-92.

[44]Kirkin V,McEwan D G,Novak I,et al.A role for ubiquitin in selective autophagy[J].Mol Cell,2009,34(3):259-269.

[45]Weidberg H,Shvets E,Elazar Z.Biogenesis and cargo selec?tivity of autophagosomes[J].Annu Rev Biochem,2011,80:125-156.

[46]Ju J S,Fuentealba R A,Miller S E,et al.Valosin-contain?ing protein(VCP)is required for autophagy and is disrupted in VCP disease[J].J Cell Biol,2009,187(6):875-888.

[47]Badadani M,Nalbandian A,Watts G D,et al.VCP associat?ed inclusion body myopathy and paget disease of bone knockin mouse model exhibits tissue pathology typical of human disease[J].PLoS One,2010,5(10):e13183.

[48]Custer S K,Neumann M,Lu H,et al.Transgenic miceex?pressing mutant forms VCP/p97 recapitulate the full spectrum of IBMPFD including degeneration in muscle,brain and bone[J].Hum Mol Genet,2010,19(9):1741-1755.

[49]Dargemont C,Ossareh-Nazari B.Cdc48/p97,a key actor in the interplay between autophagy and ubiquitin/proteasome cata?bolicpathways[J].Biochim BiophysActa,2012,1823(1):138-144.

[50]Krick R,Bremer S,Welter E,et al.Cdc48/p97 and Shp1/p47 regulate autophagosome biogenesis in concert with ubiqui?tinlike Atg8[J].J Cell Biol,2010,190(6):965-973.

[51]Ossareh-Nazari B,Bonizec M,Cohen M,et al.Cdc48 and Ufd3,new partners of the ubiquitin protease Ubp3,are re?quired for ribophagy[J].EMBO Rep,2010,11(7):548-554.

[52]Tanaka A,Cleland M M,Xu S,et al.Proteasome and p97 mediate mitophagy and degradation of mitofusins induced by Parkin[J].J Cell Biol,2010,191(7):1367-1380.

[53]Rusten T E,Stenmark H.How do ESCRT proteins control au?tophagy[J]?J Cell Sci,2009,122:2179-2183.