于孟蘭，倪金鳳

(山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物國家重點實驗室，濟南 250100)

漆酶(laccase，EC 1.10.3.2)，是多銅氧化酶家族(multicopper oxidases，MCOs)中的最大組成部分，具有較廣的底物范圍，能夠氧化雙酚、氨基或甲氧基替代單酚、芳香二元胺、羥酚氨成分和木質(zhì)素［1］。漆酶廣泛存在于真菌、高等植物、細菌和昆蟲中，在不同的物種中發(fā)揮著不同的作用。植物來源的漆酶主要參與木質(zhì)素的生物合成與降解［2］。細菌漆酶［3］主要在黑色素產(chǎn)生、芽胞壁防御、形態(tài)發(fā)生和銅離子脫毒等方面起作用。真菌漆酶主要與色素生成、植物致病和木質(zhì)素降解有關(guān)［4］;而昆蟲漆酶主要參與木質(zhì)素的氧化和昆蟲角質(zhì)層的鞣化。另外，漆酶在紡織、制漿、食品應(yīng)用等方面都有廣泛的用途［5］。

目前，關(guān)于木質(zhì)素降解的研究主要集中于絲狀擔(dān)子菌(白腐菌和棕腐菌)。白腐菌通過氧化、脫甲基化等途徑實現(xiàn)木頭中木質(zhì)素的降解［6］。而棕腐菌則能夠繞過木質(zhì)素屏障，通過對木質(zhì)素進行微小的修飾來移除半纖維素和纖維素［7］。在復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境(如昆蟲腸道)中，微生物群體而非單個物種參與木質(zhì)素降解，從而增加了研究難度。已有研究發(fā)現(xiàn)白蟻腸道微生物具有降解纖維素的能力［8］，但是木質(zhì)素如何被降解還沒有清晰地闡述［9］。Ni等［10］概述了木質(zhì)素在白蟻腸道中的結(jié)構(gòu)變化，Geib等［11］通過檢測木質(zhì)素在光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)和溼木白蟻(Zootermopsis angusticollis)腸道內(nèi)的化學(xué)變化，證實了昆蟲腸道具有木質(zhì)素的降解或修飾能力。

漆酶是重要的木質(zhì)素降解酶之一。盡管昆蟲角質(zhì)層漆酶活性發(fā)現(xiàn)［12］已經(jīng)超過50年，但是直到最近通過基因沉默的方法將昆蟲角質(zhì)層中的漆酶基因沉默，昆蟲漆酶參與角質(zhì)層鞣化、色素沉積等功能才真正被證實［13］。目前，基因組測序的廣泛應(yīng)用使得昆蟲漆酶的尋找變得簡單。研究人員發(fā)現(xiàn)一個昆蟲中存在多種漆酶基因，說明不同的漆酶可能在昆蟲生理上發(fā)揮不同的功能［14－15］。

本文中筆者主要對國內(nèi)外昆蟲漆酶的研究進行總結(jié)，展示昆蟲漆酶的研究現(xiàn)狀，挖掘昆蟲漆酶的應(yīng)用潛力。

1 昆蟲漆酶的種類與分布

根據(jù)酶生理作用的不同，將昆蟲漆酶主要分為漆酶1(laccase-1)和漆酶2(laccase-2)。漆酶1分布于昆蟲的多種組織器官中，如唾液腺、中腸、馬氏管等;而漆酶2主要分布于表皮、卵殼等組織中。其中，漆酶2已經(jīng)被證明與角質(zhì)層的鞣化有關(guān)［13］，對昆蟲漆酶1的研究推測該酶主要參與食物的脫毒［15］。

2 昆蟲漆酶的序列信息

與植物和真菌來源的漆酶相比，昆蟲漆酶既有其相同之處也有其獨特之處。相同之處表現(xiàn)為:①均含有1型(Type-1，T1)銅離子結(jié)合位點和2型/3型(Type-2/Type-3，T2/T3)位點構(gòu)成的銅離子結(jié)合簇［16］。在這2個活性區(qū)域中，有10個保守的組氨酸和1個保守的半胱氨酸。②大多數(shù)漆酶是分泌型的，含有信號肽。③漆酶序列中含有多個糖基化位點。昆蟲漆酶的獨特之處為:①昆蟲漆酶具有較長的N-末端序列。在漆酶第1個銅離子結(jié)合的組氨酸前面，真菌和植物來源的漆酶大約有60個氨基酸，而昆蟲漆酶有大約200到400個氨基酸的殘基。②昆蟲漆酶N-末端相似性較低，差異較大。但在所有已知昆蟲漆酶序列中，都含有一段特有的半胱氨酸-X-精氨酸-X-半胱氨酸(C-X-R-X-C)基序以及下游的多半胱氨酸序列，大約位于第1個銅離子結(jié)合組氨酸上游90個氨基酸的位置，而這段序列在植物和真菌漆酶中不存在［15］。③昆蟲漆酶的T1銅離子中心含有一個保守的甲硫氨酸，而在真菌或植物漆酶中，這個保守的氨基酸大多為苯丙氨酸或者亮氨酸。由于這個氨基酸的不同，導(dǎo)致漆酶在T1區(qū)域的幾何結(jié)構(gòu)不同，從而使漆酶的氧化還原電位發(fā)生改變［17－18］。

漆酶工程數(shù)據(jù)庫(laccase engineering database，LccED)是第1個多銅氧化酶的數(shù)據(jù)庫，包含漆酶和多銅氧化酶的序列信息［16］。在 LccED(http:∥www.lcced.uni-stuttgart.de)中有11個超家族(超家族A～K)，包含56個亞家族。其中，昆蟲漆酶屬于超家族C，包括8個同源亞家族，排列為C1～C8。截至2013年5月28日，共有230個預(yù)測為漆酶或者多銅氧化酶的蛋白，包含275條序列，其中漆酶1的蛋白序列占11.7%，漆酶2占10%。目前，仍沒有昆蟲漆酶的晶體結(jié)構(gòu)被解析出來。

3 昆蟲漆酶的研究方法

分布于唾液腺、馬氏管等組織的漆酶較易提取，直接解剖獲得組織，研磨后離心，進行活性檢測即可。而角質(zhì)層中的漆酶因與角質(zhì)層緊緊地結(jié)合在一起，使其性質(zhì)研究受到很大的阻礙。早期研究使用的方法主要有:①酶解法，例如用胰蛋白酶或糜蛋白酶處理角質(zhì)層，獲得酶懸液。②化學(xué)提取法，如使用四硼酸鉀和抗壞血酸的混合液或者尿素處理角質(zhì)層將漆酶溶解出來［19］。但是，這2種方法有一些局限性，且不穩(wěn)定。近年來，新發(fā)展起來的基因組、轉(zhuǎn)錄組、質(zhì)譜分析等技術(shù)為昆蟲漆酶基因的獲得提供了方便，如對黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、家蠶(Bombyx mori)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)的基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)了更多的漆酶基因。通過基因克隆的方法，可以對角質(zhì)層漆酶的表達情況進行研究［15］。而 RNAi［20］技術(shù)則為研究昆蟲漆酶參與角質(zhì)層硬化等體內(nèi)功能提供更直接的證據(jù)。

4 昆蟲漆酶的體內(nèi)功能

4.1 昆蟲漆酶參與木質(zhì)素的降解或食物脫毒

漆酶是真菌木質(zhì)素降解中很重要的一個酶，對于昆蟲漆酶的研究，多集中于漆酶2在昆蟲外骨骼的硬化、表皮色素沉積和角質(zhì)層鞣化方面的作用［21］，而對漆酶 1 的研究進展不大。Arakane 等［13］對赤擬谷盜(Tribolium castaneum)漆酶基因TcLac1進行沉默，但是沒有觀察到任何表型，以至于不能對TcLac1的功能得出結(jié)論。

對分布于煙草天蛾(Manduca sexta)馬氏管和中腸中的漆酶MsLac1進行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)煙草天蛾進食后，漆酶基因MsLac1在馬氏管和中腸組成型高表達，而在幼蟲開始休眠時消失。因為馬氏管和中腸在功能上與昆蟲脫毒有關(guān)［22］，所以推測MsLac1可能與食物中的有毒成分氧化或脫毒有關(guān)［15］，或者參與離子代謝［23］。

Gorman等［14］研究發(fā)現(xiàn)岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)的多銅氧化酶AgMCO1也存在于馬氏管和中腸。當(dāng)對雌性岡比亞按蚊注射血液時，AgMCO1的表達量上調(diào)，說明AgMCO1可能參與離子代謝。但因雄性岡比亞按蚊、黑腹果蠅和煙草天蛾能夠不依賴血液存活，說明AgMCO1的功能不僅僅是血液離子的脫毒。當(dāng)注射細菌時，AgMCO1的基因轉(zhuǎn)錄與其在黑腹果蠅中的同源物一樣，都出現(xiàn)明顯地上調(diào)表達，表明AgMCO1可能參與昆蟲體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)。

黑尾葉蟬(Nephotettix cincticeps)的唾液腺在昆蟲與水稻相互作用中發(fā)揮重要作用。黑尾葉蟬有2種漆酶1:NcLac1S和NcLac1G。NcLac1S只在唾液腺表達，而NcLac1G的表達在角質(zhì)層、馬氏管、中腸、唾液腺中都能檢測到［24］。原位雜交實驗證明，NcLac1S在唾液腺的V-cell中高度表達，這與之前的研究結(jié)果吻合。因此有學(xué)者認(rèn)為，黑尾葉蟬唾液腺漆酶能夠通過氧化作用，對水稻中的單酚進行脫毒作用，繼而形成無毒的聚合物，并通過醌鞣化反應(yīng)，使螫針鞘中出現(xiàn)的凝膠快速氧化［24－25］。

因白蟻能夠有效利用難分解的木質(zhì)纖維素，并將其轉(zhuǎn)化為自身或者共生生物利用的能量，其在生物能源中的潛在應(yīng)用受到廣泛關(guān)注［9］。對低等白蟻黃肢散白蟻(Reticulitermes flavipes)腸道的宏轉(zhuǎn)錄組分析，在宿主文庫中發(fā)現(xiàn)了6條漆酶轉(zhuǎn)錄組序列，而在共生生物的文庫中沒有發(fā)現(xiàn)，說明漆酶為宿主來源［26］。將這些序列與其他昆蟲的漆酶進行序列比對，發(fā)現(xiàn)具有很高的同源性，也支持其為昆蟲來源漆酶。以焦棓酸［1］為底物進行活性檢測，證實黃肢散白蟻腸道漆酶具有氧化焦棓酸的能力［27］但不能氧化酪氨酸、多巴胺和其他黑色素前體，說明該酶沒有昆蟲角質(zhì)層漆酶的功能。Coy等［26］將黃肢散白蟻的漆酶基因RfLac異源表達后進行活性分析，證明其具有木質(zhì)素降解能力。

高等培菌白蟻的外部共生真菌，具有很高的漆酶活性，推測在培菌白蟻木質(zhì)素降解中發(fā)揮重要的作用［28］。筆者所在課題組對培菌白蟻黃翅大白蟻中腸進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了預(yù)測為漆酶的轉(zhuǎn)錄組序列，與其他昆蟲來源的漆酶序列進行系統(tǒng)進化樹比較，證實為昆蟲來源。該漆酶的功能尚不清楚。

4.2 昆蟲漆酶參與角質(zhì)層鞣化、硬化和色素化

昆蟲外骨骼和/或角質(zhì)層除了給昆蟲提供保護作用外，還在昆蟲的運動、呼吸和交流方面發(fā)揮重要的作用。角質(zhì)層由表皮細胞分泌，并由上表皮和前表皮組成。在昆蟲的角質(zhì)層中，來源于多巴胺和二羥基苯乙醇的鄰苯二酚被氧化生成醌，并與昆蟲前表皮中的蛋白相交聯(lián)，然后昆蟲角質(zhì)層實現(xiàn)鞣化［29］。鄰苯二酚的氧化主要由存在于昆蟲角質(zhì)層中2種不同類型的酚氧化酶(酪氨酸酶和漆酶)催化完成。酪氨酸酶具有一元酚單氧酶(monophenol monooxygenase，EC 1.14.18.1)活性，可以將一元酚羥化產(chǎn)生 o-苯二酚，然后發(fā)揮兒茶酚氧化酶(catechol oxidase，o-diphenol oxidase，EC 1.10.3.1)的活性，將o-苯二酚氧化成相應(yīng)的苯醌。漆酶雖然缺少酪氨酸酶的單加氧酶活性，卻能氧化o-苯二酚和p-苯二酚。針對酪氨酸酶已經(jīng)做了很多的研究，且已被證實能在鞣化、傷口愈合和昆蟲免疫方面發(fā)揮很大的作用［30］，雖然關(guān)于漆酶在這方面的研究很少，但仍有很多證據(jù)表明漆酶在角質(zhì)層骨化過程中發(fā)揮重要的作用［31］。

Yamazaki［32］在黑果蠅(D.virilils)的蛹殼中發(fā)現(xiàn)了一個與蛹殼硬化有關(guān)的酚氧化酶。酶活性分析發(fā)現(xiàn)，在蛹殼開始形成階段，能夠檢測到酶活性，并在蛹殼形成后3 h達到最大酶活。通過對該酶的性質(zhì)鑒定，確定為漆酶。在黑腹果蠅的蛹殼角質(zhì)層中，也發(fā)現(xiàn)類似的酶。以甲基氫醌為底物對銅綠蠅(Lucilia cuprina)3齡幼蟲角質(zhì)層中溶解出來的酶進行活性分析，發(fā)現(xiàn)在蛻皮期酶的氧化活性與脫皮的相關(guān)性較好，活性在休眠早期很低，而在蛹化期則增加至之前的5倍［33］。

對家蠶中存在的漆酶進行純化分析發(fā)現(xiàn)了BmLaccase2。該漆酶在蛻皮前的上皮中高度表達，但在新蛻皮蛹的角質(zhì)層中卻不能檢測到該漆酶的活性，只能在蛻皮結(jié)束的幾小時后檢測到，表明該漆酶以無活性的酶原形式生成，然后在蛻皮后被激活［19］。

采用RANi技術(shù)將赤擬谷盜的漆酶2基因沉默，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)層不能硬化，同時伴有角質(zhì)層不能染色和軀體殘疾［34－35］，且導(dǎo)致個體在脫皮期死亡。而采用同樣的方法敲除漆酶1或酚氧化酶酪氨酸酶對角質(zhì)層的鞣化沒有影響。對松墨天牛(Monochamus alternatus)漆酶2的敲除得出了與赤擬谷盜類似的結(jié)果。說明漆酶2在角質(zhì)層鞣化、形態(tài)學(xué)和色素沉積等方面發(fā)揮重要的作用［36］。對岡比亞按蚊進行基因組分析［14］，對家蠶［19］和煙草天蛾［37］進行質(zhì)譜分析，也鑒定出了漆酶2。

對半翅類昆蟲椿象的3個屬的點蜂緣蝽(Riptortus pedestris，Alydidae)、孔背長椿象(Nysius plebeius，Lygaeidae)和 臭蝽(Megacopta punctatissima，Plataspidae)的漆酶2進行研究，發(fā)現(xiàn)在蛻皮前，漆酶2基因在表皮組織高度表達，而當(dāng)用RNAi技術(shù)將漆酶2基因沉默則使蛻皮后的色素沉積被阻礙，且這種阻礙具有劑量依賴性［21］。

4.3 昆蟲漆酶的其他功能

對意蜂(Apis mellifera)的漆酶2(Amlac2)進行研究，表明Amlac2的表達受蛻皮激素調(diào)控，且對成年蜜蜂外骨骼的分化有重要的作用［38］。對白紋伊蚊(A.albopictus)的漆酶2研究發(fā)現(xiàn)，漆酶2對其蛋殼硬化和色素沉積發(fā)揮重要的作用。因雌性白紋伊蚊在吸食血液后，漆酶2基因上調(diào)，預(yù)測漆酶2與白紋伊蚊卵巢的發(fā)育有關(guān)［39］。

對淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)的漆酶2(CpLac2)的研究表明，CpLac2不僅在蛋殼的鞣化和角質(zhì)層的硬化方面發(fā)揮作用，當(dāng)分別對藥敏感和不敏感的淡色庫蚊中CpLac2的表達量進行分析時，發(fā)現(xiàn)對藥不敏感的淡色庫蚊過表達CpLac2。這說明，CpLac2可能會通過加固蛋殼的角質(zhì)層，以降低農(nóng)藥的滲透率［40］。

在瘤姬蜂(Pimpla hypochondriaca)的毒囊中也存在漆酶PhLac1，且具有L-多巴胺氧化活性，說明該酶可能與鞣化途徑有關(guān)。或者，該酶可能通過引起血細胞裂解或阻止擬寄生幼蟲的包裝以規(guī)避宿主的免疫系統(tǒng)［41］。

4.4 昆蟲漆酶酶學(xué)性質(zhì)分析

酶的底物特異性、米氏常數(shù)分析為掌握酶的功能提供了很高的參考價值。Dittmer等［42］通過對家蠶、紅頭麗蠅(Calliphora vicina)、黑腹果蠅、黑果蠅、銅綠蠅、煙草天蛾、黑尾葉蟬等漆酶酶活性分析發(fā)現(xiàn)，漆酶的最適pH呈酸性，并且具有很高的熱穩(wěn)定性，除了對內(nèi)生底物乙酰多巴胺(N-acetyldopamine，NADA)和 丙 氨 酰 多 巴 胺 (N-β-alanyldopamine，NBAD)具有很高的活性外，還能分別在以甲基鄰苯二酚 (4-methylcatechol，4-MC)和 甲 基 氫 醌(methylhydroquinone，MHQ)為底物的反應(yīng)中觀察到高活性。而對歐美散白蟻唾液腺及前腸的漆酶酶活性測定發(fā)現(xiàn)，該漆酶對2，6-DMP和焦棓酸具有很高的氧化能力，但不能氧化左旋多巴(L-DOPA)，也說明白蟻腸道的漆酶可能參與木質(zhì)素氧化［26］。表1為目前已經(jīng)進行酶學(xué)性質(zhì)分析的昆蟲漆酶及其對應(yīng)的基因序列號的信息匯總。

表1 酶學(xué)性質(zhì)分析的昆蟲漆酶Table 1 Characterized insect laccases

漆酶酶活性分析數(shù)據(jù)中，測定米氏常數(shù)的數(shù)據(jù)較少，僅發(fā)現(xiàn)家蠶、紅頭麗蠅、煙草天蛾和鼠麗蠅來源的漆酶有相關(guān)的米氏常數(shù)測定數(shù)值。其中最大和最小的米氏常數(shù)均在煙草天蛾漆酶實驗組，所對應(yīng)的底物分別為二羥基苯丙氨酸(DOPA)和甲基氫醌［46］。Groman等［47］分別對赤擬谷盜和岡比亞按蚊漆酶2的4個亞型漆酶的米氏常數(shù)進行測定。結(jié)果表明，其中2個亞型A和B的底物特異性沒有大的差異，并得出漆酶2的亞型可能在體內(nèi)氧化相同的底物，而各亞型在功能上的差異還需要進一步的實驗驗證。

5 結(jié)論

漆酶在細菌、真菌、高等植物中都發(fā)揮著非常重要的作用，在昆蟲中也不例外。近十年對昆蟲漆酶功能研究證明漆酶2廣泛參與昆蟲角質(zhì)層的鞣化，而漆酶1可能參與木質(zhì)素的脫毒;同時，低等白蟻腸道內(nèi)源性漆酶的發(fā)現(xiàn)為昆蟲可能參與木質(zhì)素的降解提供證據(jù)。角質(zhì)層鞣化、硬化和色素沉積對昆蟲的生長、發(fā)育、存活是必需的，應(yīng)用漆酶2參與昆蟲角質(zhì)層鞣化這一特性，為研制生物殺蟲劑提供了實驗依據(jù)。雖然通過基因組、轉(zhuǎn)錄組等測序技術(shù)使得昆蟲漆酶序列的發(fā)現(xiàn)變得更為容易，但還需要更多的實驗證據(jù)對昆蟲漆酶的重要性進行支持和驗證，昆蟲漆酶也有更多的潛力值得挖掘。

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