鄒 根，劉 睿，魏勇軍，周志華，嚴(yán) 興

(中國科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032)

木質(zhì)纖維素是地球上蘊(yùn)藏太陽能量最大的部分，具有可再生和儲量豐富等優(yōu)點(diǎn)，僅把每年再生的木質(zhì)纖維素折合成能量就相當(dāng)于目前人類每年消耗化石能量的20倍［1］。充分利用木質(zhì)纖維素作為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的原材料是我國經(jīng)濟(jì)社會可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。木質(zhì)纖維素必須經(jīng)過不同程度的水解后才能轉(zhuǎn)化為農(nóng)業(yè)(動物飼料)、工業(yè)(溶劑及其他化學(xué)品，造紙和紡織原料)及能源(燃料乙醇)等行業(yè)所需的生產(chǎn)原料。采用生物酶系降解木質(zhì)纖維素來取代原有酸堿水解的方法，不僅可以提高木質(zhì)纖維素原料的利用率，而且可以極大地減少對環(huán)境的污染［2］。因此，如何構(gòu)建高效的纖維素降解酶系以適應(yīng)不同行業(yè)的需求，是未來發(fā)展綠色生產(chǎn)工藝所需的核心技術(shù)。

工業(yè)上木質(zhì)纖維素酶主要由絲狀真菌生產(chǎn)，但是其酶系存在種類不均衡、最適pH偏酸性、耐熱性較差等問題，限制了其應(yīng)用范圍和效果。例如，在燃料乙醇和丁醇的制造過程中，工藝要求將木質(zhì)纖維素中的纖維素和半纖維素都盡可能地降解為容易發(fā)酵的單糖，但常用的里氏木霉(Trichoderma reesei)的自身酶系(主要以外切酶為主)將纖維二糖轉(zhuǎn)化為單糖的速度很慢，所以往往需要加入β-葡萄糖苷酶，以加快單糖的轉(zhuǎn)化。又如，在造紙工藝中，要求降解木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素和半纖維素而保留其中的纖維素，因此要求絲狀真菌的酶系具有比較低的內(nèi)切葡聚糖酶活性和比較高的半纖維素酶活性。由于不同工藝對于酶系的耐熱性和pH特性有不同的要求，并且不同種類和來源的原材料在木質(zhì)纖維素的組成上差別很大，因此要求對酶系的組成作相應(yīng)調(diào)整。為了適應(yīng)不同原料和不同工藝的需求，經(jīng)常要對工業(yè)菌株的酶系進(jìn)行改造，復(fù)配甚至重構(gòu)。而實(shí)現(xiàn)工業(yè)菌株酶系的改造，首先要了解高效木質(zhì)纖維素酶系的一般規(guī)律;其次，需要收集豐富的木質(zhì)纖維素酶基因資源作為候選基因;最后，如何在絲狀真菌中實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)并精確調(diào)控酶系中不同成分的豐度也是酶系改造、復(fù)配和重構(gòu)亟須解決的關(guān)鍵技術(shù)問題［3］。

1 自然界木質(zhì)纖維素高效轉(zhuǎn)化微生物系統(tǒng)的酶系組成解析

木質(zhì)纖維素由纖維素，半纖維素和木質(zhì)素組成，具有組成成分復(fù)雜、異質(zhì)、結(jié)構(gòu)高度聚合的特性。纖維素是D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵組成的長鏈，在這些長鏈之間通過氫鍵與范德華力等作用形成高度有序的結(jié)晶聚合物(纖維素束)［4-5］。半纖維素的主鏈主要由木糖和甘露糖構(gòu)成，側(cè)鏈由阿拉伯糖和半乳糖等單糖和很多非糖基團(tuán)構(gòu)成［4-5］。木質(zhì)素則是含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性高聚物。雖然木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，一般情況下在自然界中很難被降解，但是自然界也存在著非常高效的纖維素降解微生菌(如Clostridium thermocellum和T.reesei等)或者微生物群落(如白蟻腸道微生物群落等)。對這些高效的微生物系統(tǒng)進(jìn)行解析，了解其中的木質(zhì)纖維素降解機(jī)制，將會為工業(yè)菌株的酶系改造、復(fù)配甚至重構(gòu)提供堅實(shí)的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

真菌及放線菌的纖維素酶游離酶系統(tǒng)和厭氧微生物的纖維小體系統(tǒng)被認(rèn)為是微生物所常用的木質(zhì)纖維素降解機(jī)制。但在一些高效纖維素降解菌中(如Caldicellulosiruptor saccharolyticus)，既沒有發(fā)現(xiàn)纖維小體相關(guān)結(jié)構(gòu)，也沒有發(fā)現(xiàn)游離酶系統(tǒng)的外切纖維素酶，這說明微生物中還存在其他的高效木質(zhì)纖維素降解機(jī)制［6-7］。近些年，隨著研究工作的深入，人們對于木質(zhì)纖維素降解機(jī)制的多樣性有了更多的認(rèn)識。

在細(xì)菌研究方面，通過對C.saccharolyticus DSM 8903和同屬其他7株菌(具有不同的纖維素降解能力)的泛基因組分析，確定一個含有GH9、GH48和CBM3結(jié)構(gòu)域的纖維素酶對于菌株的高纖維素降解能力起關(guān)鍵作用［8］。敲除纖維素降解菌Clostridium phytofermentans ISDg一個屬于GH9家族的纖維素酶Cphy3367(基因)之后，該菌就不能在以纖維素為唯一C源的培養(yǎng)基上生長，這說明該纖維素酶在C.phytofermentans ISDg的酶系中起到了關(guān)鍵作用［9］。

在絲狀真菌研究方面，通過對里氏木霉的工業(yè)菌株Rut C30和其野生菌株的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的比較研究［10-13］，深入闡述工業(yè)菌株高產(chǎn)纖維素酶的機(jī)制。首先，工業(yè)菌株中碳代謝阻遏因子Cre1的部分缺失使其木質(zhì)纖維素酶合成不再受到葡萄糖的阻遏。同時，該菌株還缺失了85 kb的大片段，其中包含和分泌途徑中糖基化修飾有關(guān)的蛋白等，這些是工業(yè)菌株能夠高效分泌纖維素酶的原因之一。此外，還發(fā)現(xiàn)里氏木霉在纖維素誘導(dǎo)下高表達(dá)的酶并局限于纖維素酶和半纖維素酶，如Swollenin、Cip1和Cip2等輔助蛋白都是高表達(dá)的蛋白，表明這些輔助蛋白在木質(zhì)纖維素降解過程中也起著重要作用。草酸青霉是由山東大學(xué)曲音波教授分離到的一株纖維素酶高產(chǎn)菌株，經(jīng)過長期的誘變獲得了產(chǎn)酶能力進(jìn)一步提高的突變株Ju-A10-T。筆者所在課題組和曲音波教授課題組合作，對草酸青霉(Penicillium oxalicum)的野生株(114-2)和突變株(JU-A10-T)進(jìn)行基因組、分泌蛋白組、轉(zhuǎn)錄組等多方面研究，揭示了草酸青霉的酶系特點(diǎn)和突變株高產(chǎn)纖維素酶的原因。草酸青霉比里氏木霉有著更加完善的酶系，例如，其β-葡萄糖苷酶不僅酶活高而且耐熱性好，有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。而突變株與野生株相比，在纖維素和麩皮誘導(dǎo)條件下分泌的酶系更加優(yōu)化，野生株114-2中較多的蛋白酶和淀粉酶在突變株JU-A10-T中的表達(dá)量明顯下降，而木質(zhì)纖維素酶比例則上升(圖1)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變株酶系的優(yōu)化除了和一些轉(zhuǎn)錄因子的突變有關(guān)外，還和一些纖維素酶本身的啟動子突變有關(guān)，這些研究無疑給進(jìn)一步優(yōu)化木質(zhì)纖維素酶系提供了極為有意義的指導(dǎo)作用［14-17］。

在微生物群落的研究方面，Pope等［18］在對袋鼠腸道微生物群落進(jìn)行元基因組學(xué)分析后，發(fā)現(xiàn)了一個新的木質(zhì)纖維素酶降解系統(tǒng)，其中負(fù)責(zé)水解產(chǎn)物(寡糖)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因(susC和susD)與淀粉水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)非常相近。中國科學(xué)院微生物研究所東秀珠教授在牦牛瘤胃的元基因組研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的木質(zhì)纖維素降解機(jī)制［19］。筆者所在課題組對培菌白蟻的腸道微生物進(jìn)行了元基因組測序，揭示了白蟻、真菌和白蟻腸道微生物之間的共生關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腸道微生物在木質(zhì)纖維素降解過程中也起到了重要的作用(水解半纖維素的支鏈和纖維寡糖)［20］。

隨著對木質(zhì)纖維素降解機(jī)制研究的深入，人們已經(jīng)認(rèn)識到木質(zhì)纖維素的降解不僅需要纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶)和種類多樣的半纖維素酶(糖基水解酶及糖酯酶)，還需要一些氧化還原酶等輔助蛋白的參與［21］。例如，糖基水解酶GH61家族，最初被認(rèn)為是一種糖苷水解酶，但最新的研究表明它實(shí)際上是一類銅離子依賴的多糖單加氧酶［22-23］，它通過氧化還原反應(yīng)催化纖維素結(jié)晶區(qū)的葡聚糖鏈斷裂，形成氧化和非氧化纖維糊精，提高纖維素的水解效率。朱紅秘孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)來源的纖維二糖脫氫酶主要通過氧化還原反應(yīng)斷裂纖維素鏈，產(chǎn)生氧化和非氧化纖維糊精，為纖維素酶提供更多反應(yīng)末端，使得里氏木霉分泌酶系對麥稈的降解效率大幅提高［24］。里氏木霉中發(fā)現(xiàn)的Swollenin，可以破壞葡聚糖鏈間的氫鍵，使大塊纖維素聚團(tuán)發(fā)生松團(tuán)并有明顯解聚現(xiàn)象，造成木質(zhì)纖維素結(jié)晶度下降從而提高纖維素酶的吸附能力［25-26］。充分利用這些木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的輔助因子，將會極大提高對木質(zhì)纖維素的利用效率。

圖1 草酸青霉主要胞外蛋白的表達(dá)情況和組成比例Fig.1 Expression levels and composition of main extracellular proteins of Penicillium oxalicum

2 木質(zhì)纖維素酶的分類和CAZy數(shù)據(jù)庫

很多序列差異很大的糖基水解酶可能催化同樣的酶反應(yīng)，同時同一種酶又往往能夠催化多種不同類型的酶反應(yīng)，所以基于酶的催化反應(yīng)類型和作用底物的EC分類方法在糖基水解酶的分類上具有明顯的缺陷。人們后來還發(fā)現(xiàn)，即使三維結(jié)構(gòu)相似的糖基水解酶也會具有完全不同的催化特性，并且很多其他的木質(zhì)纖維素酶也有類似的特點(diǎn)。由于木質(zhì)纖維素酶的結(jié)構(gòu)與功能之間存在復(fù)雜的對應(yīng)關(guān)系，所以建立一個能夠體現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的分類系統(tǒng)，是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素酶基因資源高效挖掘和利用的關(guān)鍵。

1991年法國科學(xué)家Bernard Henrissat提出按照氨基酸序列的相似性來對糖基水解酶進(jìn)行分類的方法。隨后，他將類似的方法擴(kuò)展到了其他參與糖及糖基復(fù)合物的合成、降解和修飾相關(guān)酶的分類上，并于1998年正式發(fā)布了在線的CAZy數(shù)據(jù)庫，其中包括糖基水解酶(GH)、糖酯酶(CE)、糖裂解酶(PL)和糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)(統(tǒng)稱為碳水化合物活性酶，carbohydrate-active enzymes，CAZyme)以及碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM)［27］。2013年，CAZy數(shù)據(jù)庫把木質(zhì)纖維素降解所需的輔助蛋白(auxiliary activities，AAs)也收錄進(jìn)來，其中主要包括了木質(zhì)纖維素降解所需的氧化還原酶［28］。目前，CAZy數(shù)據(jù)庫已成為注釋碳水化合物活性酶并進(jìn)行功能預(yù)測的重要依據(jù)，幾乎所有分析微生物基因組與元基因組的研究工作都會參考此數(shù)據(jù)庫［29］。隨著基因組和元基因組測序的開展，CAZy數(shù)據(jù)庫已收集糖基水解酶序列超過13萬余條(分為131個家族，但其中5個家族已經(jīng)被取消)，多糖裂解酶序列超過3 000條(分為22個家族)，糖酯酶序列超過1萬條(分為16個家族)［27］。其中有49個糖基水解酶家族、10個糖酯酶家族及3個多糖裂解酶家族與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)。

隨著序列數(shù)量的增多，基于CAZy數(shù)據(jù)庫的分類系統(tǒng)也遇到了一些問題和挑戰(zhàn)。首先，新增的序列中大多數(shù)都沒有進(jìn)行酶活性分析。到2007年底，只有不到10% 的序列做過酶學(xué)活性分析，現(xiàn)在這一比例還在不斷降低，這導(dǎo)致CAZy數(shù)據(jù)庫在序列功能預(yù)測和注釋方面越來越不可靠［27］。其次，隨著序列數(shù)量的增多，CAZy數(shù)據(jù)庫分類已經(jīng)顯得越來越粗糙，通常僅包括了clan和family2個基本的層次，只有少數(shù)家族進(jìn)行了subfamily劃分，這樣粗層次的分類造成了同一家族內(nèi)包含了多種不同活性和底物特異性的酶，不一致的功能信息還會影響新序列的 功 能 預(yù) 測［30-31］。 針 對 以 上 問 題，Bernard Henrissat團(tuán)隊(duì)對CAZy數(shù)據(jù)庫中的GH5、13和30家族做了進(jìn)一步的亞家族分類。以與木質(zhì)纖維素的降解密切相關(guān)的GH5家族為例，它是整個CAZy中最大的家族之一，通過亞家族分類，其80%的基因被劃分到51個不同的亞家族中。有31個亞家族做過酶學(xué)分析，其中的17個亞家族都只對應(yīng)了一種酶活性，剩余的14個亞家族雖然對應(yīng)2種以上的酶活性，但是往往以一種酶活性為主［30］。GH5家族的亞家族劃分也與其來源菌種所處的系統(tǒng)發(fā)育地位一致。這些結(jié)果說明:對CAZy數(shù)據(jù)庫收錄基因做進(jìn)一步的整理與系統(tǒng)分類，可以更好地反映基因序列結(jié)構(gòu)與其功能、來源物種和系統(tǒng)發(fā)育地位之間的相關(guān)性，而一個優(yōu)良的分類系統(tǒng)對于木質(zhì)纖維素酶基因資源的挖掘和應(yīng)用是非常關(guān)鍵的。

由于需要進(jìn)行大量的序列精確比對以及應(yīng)用多種方法來構(gòu)建可靠的系統(tǒng)進(jìn)化樹，所以亞家族的劃分費(fèi)時費(fèi)力，這也是相關(guān)工作進(jìn)展緩慢的重要原因。最近，Busk等［32］提出了一種肽段模式識別(peptide pattern recognition)算法來進(jìn)行亞家族的劃分。這種方法首先需要建立每個亞家族的保守肽段庫，然后根據(jù)糖基水解酶所具有的保守肽段的數(shù)量來確定亞家族的歸屬。因?yàn)椴挥眠M(jìn)行大量的序列比對和建樹的工作，所以這是一種簡單快速的方法，而且也獲得了很好的分類結(jié)果［32］。相信這種方法在將來不僅會用于糖基水解酶的分類，而且也有可能應(yīng)用于其他的木質(zhì)纖維素酶的分類。

木質(zhì)纖維素酶往往都具有多個結(jié)構(gòu)域，以上所述的分類方法，基本上都只考察了催化結(jié)構(gòu)域的序列，而對非催化結(jié)構(gòu)域則基本不予考慮。最近的研究表明，非催化結(jié)構(gòu)域?qū)τ诿傅墓δ芤灿泻苊黠@的作用［33］，所以非催化結(jié)構(gòu)域在木質(zhì)纖維素酶的精細(xì)分類方面可能也會起到一定的作用。

3 木質(zhì)纖維素酶基因資源的挖掘

3.1 通過基因組和元基因的序列注釋

隨著測序技術(shù)的進(jìn)步，已經(jīng)有越來越多的微生物基因組、轉(zhuǎn)錄組和元基因組被測序。目前，已經(jīng)有23 910個細(xì)菌基因組、649個古菌基因組和5 818個真核生物基因組或轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)完成測序或正在測 序［34-35］，其 中 包 括 了 C.thermocellum ATCC 27405、Acidothermus cellulolyticus 11B、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903、C.phytofermentans ISDg 和絲狀真菌 T.reesei、P.oxalicum、Myceliophthora thermophila、Thielavia terrestris等高效降解木質(zhì)纖維素的微生物［36］。Medie等［37］發(fā)現(xiàn)大約 40%的細(xì)菌基因組中至少含有1個纖維素酶基因，而在纖維素降解菌的基因組中木質(zhì)纖維素酶基因的數(shù)量更高。這些基因組序列是獲取新的木質(zhì)纖維素酶基因資源的重要來源。

在元基因組測序方面，目前已完成396個測序項(xiàng)目(包含3 070個試樣)，包括了瘤胃、白蟻腸道、厭氧沼氣發(fā)酵系統(tǒng)等許多木質(zhì)纖維素高效降解系統(tǒng)的元基因組數(shù)據(jù)［35］。Hess等［38］對牛瘤胃中柳枝稷上黏附的細(xì)菌進(jìn)行了元基因組測序分析，共發(fā)現(xiàn)了27 755個新的碳水化合物活性酶基因(主要是木質(zhì)纖維素降解基因)。這些獲得的新基因極大地擴(kuò)展了碳水化合物活性酶基因的數(shù)量，同時也表明元基因組是獲取新的木質(zhì)纖維素酶基因資源的重要來源［38］。但是由于元基因測序大多數(shù)使用二代高通量測序技術(shù)(454、Solexsa或者SOLiD)，序列較短且多數(shù)未能拼接，所以大部分都是不完整的基因序列。隨著測序技術(shù)的進(jìn)步(讀序更長、序列更多)和拼接技術(shù)的完善，可以預(yù)期通過對元基因組注釋獲得數(shù)量更多、質(zhì)量更高的木質(zhì)纖維素酶基因資源。

如何對這些大量的基因組、轉(zhuǎn)錄組和元基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行高通量的、準(zhǔn)確的注釋，是進(jìn)行木質(zhì)纖維素酶基因資源挖掘所需要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題。對木質(zhì)纖維素降解基因進(jìn)行注釋的基本方法是通過blast和hmm-search，通過找到相似序列來進(jìn)行家族分類和功能預(yù)測。目前，dbCAN數(shù)據(jù)庫(http:∥csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/)可以在線對用戶提交的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行自動而全面的碳水化合物活性酶注釋(涵蓋了木質(zhì)纖維素酶基因)［29］，并且dbCAN數(shù)據(jù)庫還對很多元基因組來源的木質(zhì)纖維素酶進(jìn)行了自動注釋和收集。

由于木質(zhì)纖維素酶基因序列的多樣性和模塊化的結(jié)構(gòu)以及(元)基因組測序產(chǎn)生的持續(xù)增加的數(shù)據(jù)量，使得CAZy數(shù)據(jù)庫在功能物種預(yù)測方面的準(zhǔn)確性大幅下降。要確定一個新發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)纖維素酶基因的功能，往往需要對幾個甚至十幾個底物進(jìn)行催化反應(yīng)分析后才能確定，這嚴(yán)重地制約了資源的利用效率。所以，要提高木質(zhì)纖維素酶基因注釋的準(zhǔn)確性和效率，則有待于在CAZy數(shù)據(jù)庫分類的基礎(chǔ)上做進(jìn)一步的完善，建立一個更加能體現(xiàn)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的分類系統(tǒng)。

3.2 通過(元)基因組文庫的功能篩選

通過(元)基因組文庫的功能篩選是獲得木質(zhì)纖維素酶基因資源的另外一種途徑，由于這種方法不依賴于已知序列的相似性，因此可以與序列注釋的方法互補(bǔ)，理論上有可能篩選到更為新穎的木質(zhì)纖維素酶基因。國內(nèi)外的研究者通過對(元)基因組文庫的功能篩選已經(jīng)從各種環(huán)境試樣中篩選到了大量新穎的木質(zhì)纖維素酶基因［39］。

利用功能篩選的方法從環(huán)境試樣中篩選木質(zhì)纖維素酶，需要構(gòu)建高質(zhì)量的元基因組文庫，但是由于某些環(huán)境下微生物群落的生物量特別低(例如白蟻腸道)，所以很難構(gòu)建出高質(zhì)量的、插入大片段的元基因組文庫。筆者所在課題組從2個方面對白蟻腸道微生物試樣的DNA提取方法進(jìn)行了優(yōu)化:一方面，建立了以胰酶解離法結(jié)合差速離心的方法，有效降低了腸道微生物DNA提取過程中來自白蟻基因組DNA的污染;另外一方面，將多重置換擴(kuò)增技術(shù)(multiple displacement amplification，MDA技術(shù))應(yīng)用于白蟻腸道元基因組DNA的全基因組擴(kuò)增，可以在群落結(jié)構(gòu)不發(fā)生明顯變化的基礎(chǔ)上獲得足夠的高質(zhì)量元基因組 DNA［40］。這些技術(shù)方法的建立，為元基因組學(xué)方法應(yīng)用于白蟻腸道微生物群落的研究打下了堅實(shí)的基礎(chǔ)，并為其他生物量低的環(huán)境試樣進(jìn)行元基因組研究提供了借鑒。利用這套技術(shù)方案，筆者所在課題組成功地構(gòu)建了一個培菌白蟻和一個食木白蟻的腸道微生物元基因組fosmid文庫并對內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶進(jìn)行了功能篩選，獲得了幾百個木質(zhì)纖維素酶陽性克隆，并克隆和表達(dá)了一些具有工業(yè)應(yīng)用前景的木質(zhì)纖維素酶，其中一個β-葡萄糖苷酶(Bgl-gs1)的最適溫度達(dá)到90℃，在75℃保溫2 h，仍然能保留70%以上的酶活性［41］。

另外，筆者所在課題組還構(gòu)建了沼氣發(fā)酵群落的元基因組fosmid文庫，并對內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶進(jìn)行了功能篩選，獲得了上千個陽性fosmid克隆。優(yōu)化了對這些fosmid克隆進(jìn)行批量測序的方案，從中獲得了大量有活性的木質(zhì)纖維素酶基因，將部分基因在絲狀真菌Rut C30中表達(dá)后，顯著優(yōu)化了絲狀真菌中Rut C30的酶系組成［42-43］。例如，將來自沼液元基因組文庫的纖維素酶基因exo2b的催化區(qū)和里氏木霉的cbh1基因通過linker融合，并用優(yōu)化后的cbh1啟動子 pcbh1m2［44］和 trpC 終止子組成表達(dá)盒［42］在里氏木霉中表達(dá)后，和出發(fā)株相比，轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液水解預(yù)處理玉米秸稈所產(chǎn)生的葡萄糖增加了19.8%(圖 2)［42，44］。

圖2 從沼氣厭氧發(fā)酵群落篩選到的內(nèi)切葡聚糖酶基因exo2b和里氏木霉自身cbh1基因融合表達(dá)示意Fig.2 Schematic structure of exo2b(an endoglucanase screened from the metagenomic library of biogas digester)fused with a Trichoderma reesei endogenous gene cbh1

因?yàn)?元)基因組文庫的構(gòu)建往往是在大腸桿菌中進(jìn)行的，所以目前功能篩選往往是以大腸桿菌為宿主來進(jìn)行的。但是由于大腸桿菌存在如密碼子偏好性和調(diào)控元件的缺失等問題，功能篩選不一定篩選到所有的具有相應(yīng)功能的基因。據(jù)Gabor等［45］的研究，元基因組文庫中的基因大約只有40%可以在大腸桿菌中表達(dá)，據(jù)此估計很多的木質(zhì)纖維素酶基因在以大腸桿菌為宿主大腸桿菌中并沒有表現(xiàn)出功能。為了解決這一問題，可以將一些寬宿主的復(fù)制元件(例如RK2載體的復(fù)制元件)加入文庫構(gòu)建載體中，這樣構(gòu)建好的元基因組文庫就可以從大腸桿菌中轉(zhuǎn)移到其他宿主(包括多數(shù)革蘭氏陰性菌和少數(shù)革蘭氏陽性菌)中進(jìn)行功能篩選［46］。

4 絲狀真菌中木質(zhì)纖維素降解基因的異源表達(dá)

因?yàn)榻z狀真菌具有豐富的木質(zhì)纖維素酶酶系，且胞外蛋白的分泌水平相比其他微生物具有很大的優(yōu)勢，所以用于工業(yè)化生產(chǎn)的纖維素酶大多來自于真菌，比較典型的生產(chǎn)菌株有木霉屬(Trichoderma)［13］、曲霉屬(Aspergillus)［47］和青霉屬(Penicillium)［14，17］等。用于纖維素酶生產(chǎn)的絲狀真菌往往經(jīng)過了長期的誘變，蛋白分泌量達(dá)到了非常高的水平，例如里氏木霉Rut C30胞外蛋白水平可達(dá) 100 g/L 以上［14，48］。

由于這些絲狀真菌自身的酶系往往不能滿足不同工藝和原材料的要求，所以需要對酶系做進(jìn)一步的完善。近年來隨著絲狀真菌遺傳操作系統(tǒng)的不斷完善，通過表達(dá)外源的木質(zhì)纖維素酶基因，可以彌補(bǔ)絲狀真菌自身酶系的不足［47］。但由于木質(zhì)纖維素酶來源豐富多樣，其中一些異源蛋白在真菌表達(dá)系統(tǒng)存在表達(dá)量較低或者難以表達(dá)的情況。為了解決這個難題，研究人員進(jìn)行了多方面的嘗試，并取得了很多有益經(jīng)驗(yàn)，主要集中在表達(dá)宿主、表達(dá)載體、外源基因優(yōu)化等幾方面。

在宿主的改造方面，主要基于早期一些通過傳統(tǒng)誘變方法選育出的優(yōu)良菌株作進(jìn)一步優(yōu)化［10］。特別是這些優(yōu)良菌株基因組的解析，對表達(dá)宿主的定向進(jìn)化提供了很大的幫助。筆者所在課題組和山東大學(xué)曲音波教授實(shí)驗(yàn)室合作對草酸青霉基因組、轉(zhuǎn)錄組和分泌蛋白組解析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(CreA、AmyR等)的相關(guān)突變是菌株纖維素酶活提高的關(guān)鍵所在［15-17］。因此，根據(jù)這些研究發(fā)現(xiàn)的調(diào)控因子，對表達(dá)宿主進(jìn)行遺傳改造后來表達(dá)異源蛋白，可以獲得較高的產(chǎn)量［11］。此外，還可以利用全局性轉(zhuǎn)錄激活因子(如Xyr1)的敲除來構(gòu)建無背景的表達(dá)宿主，再通過組成型表達(dá)啟動子可以獲得較純的目標(biāo)纖維素酶［49-50］。宿主分泌途徑中一些蛋白酶體會降解不能夠正確折疊的異源蛋白，對這些蛋白酶體進(jìn)行敲除可以提高異源蛋白的分泌量，同時該途徑中的Pdi等分子伴侶的過表達(dá)也可以提高蛋白的表達(dá)量［51］;異源蛋白分泌到胞外以后，還有可能被胞外蛋白酶降解，也有研究者通過敲除胞外蛋白酶來提高異源蛋白的成功率［47，52］。筆者所在課題組通過對里氏木霉和畢赤酵母的分泌途徑進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，木霉分泌途徑的糖基化水平更加適合真菌來源的BglS的表達(dá)，可以獲得更高的活性和穩(wěn)定性［53］，這和Rut C30在誘變過程中導(dǎo)致的分泌能力增強(qiáng)有關(guān)。木霉中獨(dú)特的ENGase endo T起了關(guān)鍵作用，它不僅可以用于其他容易過糖基化的表達(dá)系統(tǒng)的改造，也可以進(jìn)一步調(diào)控其表達(dá)量，將木霉改造成適合不同糖基化程度的表達(dá)宿主，這些都說明里氏木霉作為一個表達(dá)宿主具有很大的應(yīng)用前景。

表達(dá)載體方面最主要是啟動子的優(yōu)化。微生物表達(dá)系統(tǒng)中的啟動子主要分為組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)組成型啟動子常用的有 gpdA、trpC、pdc、pki等強(qiáng)組成型啟動子［49-50］，一般用于不需要誘導(dǎo)的發(fā)酵條件。誘導(dǎo)型啟動子，在某些誘導(dǎo)條件下比gpdA等組成型啟動子效果要好很多，而木質(zhì)纖維素酶的發(fā)酵本身就是誘導(dǎo)條件，因此選用如cbh1等強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動子是表達(dá)纖維素酶的首選［54］。但是這些啟動子上的很多誘導(dǎo)和阻遏因子(Xyr1、Cre1、ACE1等)的結(jié)合位點(diǎn)影響著外源基因的轉(zhuǎn)錄水平，筆者曾通過在cbh1啟動子上用激活因子ACE2和Hap2/3/5蛋白復(fù)合體的結(jié)合位點(diǎn)取代阻遏因子Cre1的結(jié)合位點(diǎn)成功提高了啟動子的活性［44］。

制約外源基因表達(dá)最關(guān)鍵的因素是基因本身?；蜣D(zhuǎn)錄、翻譯、再到分泌，均存在一些內(nèi)源基因不會遇到的問題。首先，不同生物對各種密碼子的使用頻率不同，絲狀真菌使用頻率高的密碼子可能在原核細(xì)胞中被用得很少。因此必須根據(jù)宿主密碼子改造基因的編碼序列，才能得到高表達(dá)的蛋白。此外，真核生物基因含有內(nèi)含子，因此真核表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源基因時可能會存在由于錯誤剪切而導(dǎo)致mRNA不穩(wěn)定的情況，目前已能根據(jù)宿主預(yù)測酶切位點(diǎn)再利用人工合成DNA或基因的定點(diǎn)突變來解決問題［34］。通過對序列優(yōu)化外源基因能夠翻譯成蛋白，但是真核表達(dá)系統(tǒng)還需進(jìn)一步通過分泌途徑才能成功將蛋白分泌到胞外，分泌途徑中會對一些錯誤折疊蛋白進(jìn)行標(biāo)記，然后進(jìn)入解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解(endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD)，而異源蛋白往往會被標(biāo)志而進(jìn)入到ERAD途徑。筆者所在課題組在里氏木霉中直接表達(dá)元基因組來源的纖維素酶基因exo2b未獲成功，和木霉中高表達(dá)的cbh1基因通過linker融合后可以成功表達(dá)，這可能是因?yàn)閮?nèi)源蛋白作為Carrier可以成功通過分泌途徑防止異源蛋白被識別進(jìn)入ERAD［42］。上述這些方法并不是對所有的異源木質(zhì)纖維素降解基因都有效。因此，如何進(jìn)一步提高異源木質(zhì)纖維素降解基因表達(dá)的成功率和表達(dá)量，是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素酶基因資源高效利用和酶系改造中亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。

5 真菌木質(zhì)纖維素酶的復(fù)配和重構(gòu)

在工業(yè)應(yīng)用中，研究人員嘗試將不同微生物來源的酶進(jìn)行復(fù)配來優(yōu)化構(gòu)建“雞尾酒”酶系，許多復(fù)合酶制劑都是在里氏木霉分泌酶系的基礎(chǔ)上復(fù)配了其他微生物來源的木質(zhì)纖維素降解酶［5，55］，這是優(yōu)化木質(zhì)纖維素酶系的重要方法。里氏木霉酶系存在β-葡萄糖苷酶酶活低(僅為3 IU/mL)、半纖維素酶類少、熱穩(wěn)定性不佳、最適pH偏酸性等問題，這極大地限制木霉纖維素酶的應(yīng)用［56］。因此，根據(jù)不同用途在木霉酶系的基礎(chǔ)上復(fù)配合適的其他來源的木質(zhì)纖維素酶是十分必要的。

Ma等［57］在里氏木霉發(fā)酵液基礎(chǔ)上額外添加草酸青霉來源的β-葡萄糖苷酶(Pbgl1)處理玉米秸稈，還原糖產(chǎn)量提高80%，添加來自白蟻腸道的β-葡萄糖苷酶則可以使還原糖產(chǎn)量提高87%［41］。通過元基因組測序從牛瘤胃微生物群落中獲得了4個活性較好的β-葡萄糖苷酶，將其中一個β-葡萄糖苷酶低劑量地添加到商品化木霉纖維素酶中，可使水解玉米秸稈的效率提高20%［58］。其次，半纖維素酶在木質(zhì)纖維素降解中也發(fā)揮重要作用，它們通過降解半纖維素使內(nèi)部的纖維素暴露出來，增加其與酶的接觸面積，提高降解效率。Gao等［59］對溫泉和草料堆肥試樣進(jìn)行菌群富集和篩選，獲得了一批耐熱性良好、酶活較高的半纖維素酶，其中包括木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-葡糖醛酸酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。在里氏木霉的纖維素酶中額外添加這些新發(fā)現(xiàn)的酶，可使水解木質(zhì)纖維過程中的木糖產(chǎn)率提高近70%，同時酶系的耐熱性和穩(wěn)定性也獲得了很大提升。近年來，越來越多研究表明木質(zhì)纖維素降解過程中除了水解反應(yīng)外，同樣存在氧化還原反應(yīng)，雖然在里氏木霉中也有多糖裂解單加氧酶，但是添加其他真菌來源的多糖裂解單加氧酶可以提高木霉酶系的水解效率［60-62］。而Swollenin、Cip1和Cip2等輔助蛋白則可以改變木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，增加木質(zhì)纖維素酶的作用效果［10，25］。在酶系復(fù)配的過程中，除了根據(jù)工藝和原料找到適當(dāng)?shù)暮蜻x酶，還需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)對酶系中不同酶的組成比例進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最佳的組成比例。酶系復(fù)配在商品化纖維素酶方面已經(jīng)獲得了應(yīng)用，諾維信和杰能科利用這種“雞尾酒”式的酶系復(fù)配方法成功彌補(bǔ)了真菌酶系的自身不足，而且避免了生產(chǎn)菌株異源表達(dá)多種基因的種種問題。目前，此方法成功應(yīng)用于他們的商品纖維素酶制劑Cellic?CTec2和Accellerase1500生產(chǎn)中。

利用復(fù)配的方法盡管可以獲得更完善的酶系，但是需要通過不同菌種發(fā)酵并根據(jù)用途進(jìn)行配比，這會導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)的步驟增多和成本升高。近年來，隨著絲狀真菌遺傳操作系統(tǒng)的完善，在技術(shù)上已經(jīng)可以做到在一個宿主中表達(dá)一個或者多個本身欠缺的木質(zhì)纖維素酶或輔助酶，并且可以進(jìn)一步敲除一些不需要的酶，從而重構(gòu)出一個全新的酶系，這將為木質(zhì)纖維素酶的酶系優(yōu)化和生產(chǎn)帶來新的技術(shù)變革。要在一個絲狀真菌宿主中合成一個能夠適應(yīng)不同工業(yè)用途的全新酶系，其關(guān)鍵在于如何精確地調(diào)控酶系中不同成分的比例，這是研究者下一步努力的目標(biāo)。

6 展望

木質(zhì)纖維素酶在食品、紡織、醫(yī)療、能源等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，但是這些酶的生產(chǎn)菌株還有進(jìn)一步優(yōu)化空間來降低生產(chǎn)成本。今后，隨著木質(zhì)纖維素酶基因資源的挖掘和功能表征，絲狀真菌遺傳操作系統(tǒng)的完善以及近年發(fā)展起來的合成生物技術(shù)方法，我們將能夠完全按照生產(chǎn)工藝和原材料的要求，對調(diào)控元件和木質(zhì)纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)元件進(jìn)行編程式組裝，在絲狀真菌中實(shí)現(xiàn)精確可控的表達(dá)，從而利用絲狀真菌“合成”出適合不同工業(yè)應(yīng)用的酶系［63］?？梢灶A(yù)見，不久的將來絲狀真菌“合成”的木質(zhì)纖維素酶系可以為人們的生活提供更加健康、環(huán)保和便捷的條件。

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