湯紅婷，侯 進(jìn)，沈 煜，鮑曉明

(山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

木質(zhì)纖維素是地球上含量最為豐富的可再生資源之一［1］。高效、廉價(jià)地把木質(zhì)纖維素資源轉(zhuǎn)化為人類所需要的能源和化工原料，對(duì)于緩解目前存在的能源、資源等危機(jī)具有重要意義。燃料乙醇是在生物質(zhì)能源中最先商業(yè)化的產(chǎn)品之一，按一定比例將其摻入汽油中，可以部分替代石油資源，降低油耗量，還可以促進(jìn)汽油的充分燃燒，減少CO2的排放。與第一代以糧食類淀粉為原料生產(chǎn)的燃料乙醇相比，第二代燃料乙醇的生產(chǎn)是利用統(tǒng)合生物加工過(guò)程(consolidated bioprocessing，CBP)將纖維素酶和半纖維素酶產(chǎn)生、纖維素水解和乙醇發(fā)酵組合在一起，以木質(zhì)纖維素為原料來(lái)高效生產(chǎn)燃料乙醇，這是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化生物乙醇的有效途徑之一。CBP有利于降低生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的成本，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，因此受到研究者的普遍關(guān)注［2-4］。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)菌株及重要的真核模式生物，是實(shí)現(xiàn)統(tǒng)合生物加工過(guò)程(CBP)極具潛力的底盤細(xì)胞。它的基因組簡(jiǎn)單，遺傳操作體系完善，可根據(jù)細(xì)胞功能實(shí)現(xiàn)多種方面的設(shè)計(jì)和改造。同時(shí)，釀酒酵母也具有生長(zhǎng)速率快、對(duì)抑制物耐受性強(qiáng)、食品級(jí)安全等優(yōu)良生產(chǎn)特征［5-6］。

木質(zhì)纖維素的高效降解是實(shí)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵點(diǎn)，降解木質(zhì)纖維素的最基本酶有3種:斷裂纖維素內(nèi)部糖苷鍵的內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases，EG)、從一端水解產(chǎn)生纖維二糖的纖維二糖水解酶(cellobiohydrolases，CBH)和催化纖維二糖為葡萄糖的 β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases，BGL)。在自然界中，能夠生產(chǎn)纖維素酶的真菌和細(xì)菌是降解木質(zhì)纖維素的主要力量。其中，某些厭氧菌利用細(xì)胞表面形成的纖維小體(cellulosome)實(shí)現(xiàn)纖維素的高效降解。纖維小體是由纖維素酶組裝到細(xì)胞表面的支架蛋白(scaffoldin)上而形成的大分子纖維素酶復(fù)合物，支架蛋白的柔韌性保證了它與纖維素底物充分而緊密的結(jié)合，并且多種纖維素酶組分之間的協(xié)同作用和鄰近效應(yīng)增強(qiáng)了各種纖維素酶的水解功能，從而賦予了纖維小體高效水解纖維素的功能。另外，多個(gè)支架蛋白的嵌合和多樣化的纖維素酶構(gòu)成的纖維小體結(jié)構(gòu)，這種復(fù)雜性也與其高效降解效率正相關(guān)［7］。與具有較高濾紙酶活的瑞氏木霉纖維素酶系相比，纖維小體對(duì)結(jié)晶纖維素(如微晶纖維素、棉花等)具有更高效的降解能力，纖維小體的比酶活大約是瑞氏木霉纖維素酶系的50倍［8-9］。目前，纖維小體被認(rèn)為是所有微生物纖維素酶系中最為有效的纖維素降解系。因此，將纖維小體高效降解纖維素過(guò)程與釀酒酵母生產(chǎn)乙醇的特性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，是實(shí)現(xiàn)CBP途徑構(gòu)建的有效方式之一。近年來(lái)，纖維小體在釀酒酵母細(xì)胞表面的展示已成為CBP酵母新的研究熱點(diǎn)。筆者主要綜述纖維小體在釀酒酵母表面展示的研究進(jìn)展，其中重點(diǎn)闡述纖維小體各元件的設(shè)計(jì)和改造，并針對(duì)釀酒酵母分泌途徑的改造提出提高人造纖維小體分泌組裝的可能性策略。

1 纖維小體的結(jié)構(gòu)和功能

厭氧菌的纖維小體結(jié)構(gòu)復(fù)雜(圖1)，具有催化活性結(jié)構(gòu)域的纖維素酶系各組分上的對(duì)接模塊(dockerins)，分別與初級(jí)支架蛋白上串聯(lián)的粘連模塊(cohensins)相互作用，形成纖維小體基本結(jié)構(gòu)單元。這種基本結(jié)構(gòu)單元通過(guò)粘連模塊-對(duì)接模塊的相互作用固定在錨定支架蛋白上，再由錨定支架蛋白自身表層同源模塊(S-layer homology module，SLH)或者分選酶基序(sortase)結(jié)合至細(xì)胞表面組裝成纖維小體。

與游離的纖維素酶不同，纖維小體的酶組分都含有對(duì)接模塊結(jié)構(gòu)域。對(duì)接模塊由2條約含有22個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)序列通過(guò)一個(gè)連接片段(linker)連接組成［10-11］。目前，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分類，對(duì)接模塊也至少包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型這3種類型［12］。纖維小體的催化模塊種類極其繁多，如熱線梭菌纖維小體組分中包含超過(guò)30種內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)，如 Cel8A、Cel9R、Cel5G 和 Cel9D等;4種外切葡聚糖酶(exoglucanase)，如 Cel48S、CelO和 CbhA 等;2種 β-葡 萄 糖 苷 酶 (βglucosidase)，如BglA;6種木聚糖酶(xylosidase)及幾丁質(zhì)酶(lichenases)、甘露糖苷酶(mannosidase)和果膠酶(pectate lyase)等［9］。

粘連模塊串聯(lián)而成的支架蛋白是纖維小體組裝過(guò)程中關(guān)鍵的非催化亞基。根據(jù)粘連模塊-對(duì)接模塊間的作用特性，對(duì)接模塊的系統(tǒng)發(fā)生圖譜在很大程度上反映了粘連模塊的對(duì)應(yīng)圖譜，所以粘連模塊至少也包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ這3種類型。某些嗜溫梭菌僅含有6～9個(gè)Ⅰ型粘連模塊的初級(jí)支架蛋白(圖1(a))，如解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)、嗜纖維梭菌(Clostridium cellulovorans)、約氏梭菌(Clostridium josui)和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)等［13-16］，與纖維素酶組裝成相對(duì)簡(jiǎn)單的纖維小體。而另一些細(xì)菌則含有多種類型的支架蛋白，復(fù)雜程度高(圖1(b)、1(c))。如熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)纖維小體具有Ⅰ和Ⅱ型2類支架蛋白，Ⅰ型支架蛋白有只含有1個(gè)Ⅰ型粘連模塊的OlpA和含有9個(gè)同源性極高的Ⅰ型粘連模塊的CipA，其中兩兩之間的最高相似度可達(dá)到100%［17］。Ⅱ型支架蛋白含有1、2、4個(gè)Ⅱ型粘連模塊的SdbA、Orf2和OlpB這3種錨定支架蛋白［9］。大部分的初級(jí)支架蛋白都含有與底物結(jié)合的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-bindinging domain，CBD)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，支架蛋白上存在的CBD能夠促進(jìn)熱纖梭菌CelS、CelD對(duì)微晶纖維素的降解能力［18-19］。Ⅰ和Ⅱ型支架蛋白的嵌合組裝，不僅增加了纖維小體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，也增加了纖維小體中酶組分的種類和數(shù)量。黃色瘤胃球菌(Ruminococcus lf avefaciens)、解纖維醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)的纖維小體結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜［20-21］，如黃色瘤胃球菌17具有4種類型的支架蛋白ScaA、ScaB、ScaC和ScaE。此外，黃色瘤胃球菌17還具有2個(gè)可能結(jié)合底物結(jié)晶纖維素的蛋白CttA，該蛋白質(zhì)的對(duì)接模塊能與ScaE的粘連模塊相互作用［22］。這樣高度集成的超分子纖維小體，可以很好地組織、協(xié)調(diào)多種酶組分發(fā)揮協(xié)同作用，從而達(dá)到木質(zhì)纖維素的高效降解。

圖1 厭氧細(xì)菌纖維小體基本結(jié)構(gòu)示意Fig.1 Basic structure of cellulosome in anaerobic bacteria

天然纖維小體自組裝是由細(xì)胞表面支架蛋白上的粘連模塊與分泌到胞外的纖維素酶上的對(duì)接模塊間通過(guò)疏水作用，并輔以較少的分子間氫鍵在胞外結(jié)合形成纖維小體結(jié)構(gòu)的過(guò)程。同種類型的對(duì)接模塊-粘連模塊之間的相互作用具有非特異性，因此，不同纖維小體酶組分能與支架蛋白上的粘連模塊隨機(jī)結(jié)合，使形成的纖維小體的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣化。同時(shí)，酶與酶之間的協(xié)同作用和鄰近作用使纖維小體對(duì)微晶纖維素底物具有很高的降解活性［9］。不同來(lái)源厭氧微生物的同類型粘連模塊序列相差很大，具有種間專一性;而不同類型的粘連模塊間的序列同源性更低。根據(jù)種間專一性，不同來(lái)源的對(duì)接模塊-粘連模塊的雜合使用，纖維素酶的定位組裝，使人工設(shè)計(jì)獲得特定纖維小體成為可能。

2 釀酒酵母人造纖維小體的表面展示

人造纖維小體是根據(jù)天然纖維小體的結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)人工設(shè)計(jì)在異源細(xì)胞表面展示出的微型結(jié)構(gòu)(圖1)。展示于細(xì)胞表面至少有2個(gè)粘連模塊的微型支架蛋白，與分泌表達(dá)帶有對(duì)接模塊的纖維素酶組分進(jìn)行胞外自組裝，形成細(xì)胞表面的微型復(fù)合物，即為人造纖維小體，也稱為纖維小體嵌合體(cellulosome chimeras)［23］。隨著對(duì)纖維小體認(rèn)識(shí)的不斷深入，纖維小體在木質(zhì)纖維素資源轉(zhuǎn)化中的巨大價(jià)值也越來(lái)越受人們的關(guān)注，更為細(xì)致復(fù)雜的人造纖維小體逐漸被設(shè)計(jì)研究，以期拓展其應(yīng)用價(jià)值與研究領(lǐng)域。

2.1 纖維素酶的來(lái)源

纖維素酶在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)構(gòu)建人造纖維小體時(shí)，其來(lái)源并不一定局限于天然纖維小體本身的纖維素酶，真菌來(lái)源的纖維素酶與特異的對(duì)接模塊融合，也可以實(shí)現(xiàn)纖維小體的組裝。最初，分別通過(guò)厭氧細(xì)菌的部分支架蛋白，將1～2個(gè)纖維素酶在釀酒酵母細(xì)胞表面組裝，構(gòu)建了簡(jiǎn)單的人造纖維小體，進(jìn)而根據(jù)纖維素酶系的復(fù)雜性，逐步展開多功能纖維小體在釀酒酵母表面展示的研究。

目前，大部分研究者都選擇了全部或部分使用天然纖維小體纖維素酶［24-27］，根據(jù)酶與酶之間的協(xié)同作用來(lái)優(yōu)化纖維小體。Tsai等［24］比較了熱纖梭菌的內(nèi)切葡聚糖酶CelA、解纖維梭菌的外切葡聚糖酶CelE以及解纖維梭菌內(nèi)切葡聚糖酶CelG組裝單功能纖維小體，發(fā)現(xiàn)纖維素降解效率最高的是CelA，最低的是CelG，說(shuō)明纖維小體酶降解纖維素能力具有一定的差異。同時(shí)，三功能纖維小體(CelA、CelE、CelG)酶之間的協(xié)同作用是游離酶的2.44倍，是兩功能(CelA、CelE)的 1.65 倍。因此，增加酶組分的種類是優(yōu)化纖維小體性能的有效途徑。但是該纖維小體的降解產(chǎn)物積累了較高的寡聚糖，以熱纖梭菌的β-葡萄糖苷酶BglA代替CelG時(shí)，促進(jìn)了葡萄糖的產(chǎn)生，這說(shuō)明了外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶是纖維素徹底水解的3種基本酶。在基本酶的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增加酶組分種類，可能會(huì)在很大程度上提高纖維小體的降解能力。

除此之外，來(lái)源于真菌的游離纖維素酶融合相應(yīng)的對(duì)接模塊后，也能參與纖維小體的構(gòu)建。Wen等［28］則將來(lái)源于瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的內(nèi)切葡聚糖酶EGⅡ和纖維二糖水解酶CBHⅡ以及棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡萄糖苷酶BGL1與熱纖維梭菌的外切葡聚糖酶CelS和內(nèi)切葡聚糖酶CelA的對(duì)接模塊融合后，通過(guò)EGⅡ和CBHⅡ?qū)α姿崤蛎浝w維素(PASC)降解產(chǎn)糖及BGL1水解纖維二糖測(cè)定，3種酶都能組裝到支架蛋白上。真菌源的纖維素酶經(jīng)過(guò)人為設(shè)計(jì)后，也可參與人造纖維小體的組裝，這就大大豐富了纖維素酶的選擇。游離酶一般都具有CBD結(jié)構(gòu)域，不同的CBD對(duì)微晶纖維素的結(jié)合位點(diǎn)也不相同［29］。因此，游離酶的使用也能增加纖維小體對(duì)底物的結(jié)合能力。厭氧細(xì)菌本身也分泌一些游離酶，但是目前還沒有研究使用此類酶進(jìn)行纖維小體的組裝。

2.2 人造纖維小體的自組裝與支架蛋白的設(shè)計(jì)

纖維小體中的酶組分分泌到胞外后，與展示于細(xì)胞表面的支架蛋白匹配結(jié)合是人造纖維小體的自組裝過(guò)程，2種組分在釀酒酵母表面形成這種匹配結(jié)合的來(lái)源方式有2種。一是纖維小體各元件在不同的細(xì)胞中甚至在不同物種的細(xì)胞中分別表達(dá)，再通過(guò)人工配比混合使纖維素酶結(jié)合到釀酒酵母細(xì)胞表面的支架蛋白上，形成纖維小體［24-25，30］。如Tsai等［24］將在大腸桿菌表達(dá)含對(duì)接模塊的纖維素酶與表面展示有支架蛋白的釀酒酵母混合于緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、100 mmol/L NaCl、10 mmol/L CaCl2)中，4℃孵育1 h，使纖維素酶充分結(jié)合到支架蛋白上，結(jié)果顯示:該釀酒酵母與單一纖維素酶組分混合，纖維素酶能夠正確組合到支架蛋白上，且能不同程度地降解磷酸膨脹纖維素(PASC)。但該釀酒酵母與多個(gè)纖維素酶組分混合，各酶組分是否參與形成纖維小體并沒有被證實(shí)。另一種則是與天然纖維小體的形成方式類似，將纖維小體各單元在同一個(gè)細(xì)胞表達(dá)［26-28］，然后在胞外實(shí)現(xiàn)自組裝。如Hyeon等［26］在釀酒酵母中共表達(dá)了支架蛋白和2種內(nèi)切葡聚糖酶，非變性PAGE電泳和內(nèi)切葡聚糖酶的羧甲基纖維素(CMC)酶譜分析結(jié)果表明:釀酒酵母表面形成了微型纖維小體，同時(shí)補(bǔ)加β-葡萄糖酶共同作用于非晶態(tài)纖維素CMC，乙醇產(chǎn)量在16 h能達(dá)到3.5 g/L。這種方式的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了纖維素酶的分離純化和控制細(xì)胞培養(yǎng)比例的過(guò)程，且單個(gè)細(xì)胞的多功能構(gòu)建也是CBP菌株的最終目的。

粘連模塊與對(duì)接模塊間的相互作用是自組裝形成人造纖維小體的前提［31-32］。支架蛋白的人工設(shè)計(jì)是人造纖維小體復(fù)雜性的因素之一，目前人工設(shè)計(jì)支架蛋白的基本策略有2種:其一，串聯(lián)同一來(lái)源的粘連模塊形成純合支架蛋白，不同纖維素酶組分則融合同樣來(lái)源的對(duì)接模塊，使纖維素酶隨機(jī)在支架蛋白上自組裝，可形成多樣性的纖維小體;其二，串聯(lián)不同來(lái)源的粘連模塊組形成雜合支架，而不同纖維素酶組分也融合上對(duì)應(yīng)來(lái)源的對(duì)接模塊，根據(jù)對(duì)接模塊與粘連模塊的專一性結(jié)合特點(diǎn)，使纖維素酶定量定位地組裝到纖維小體上。

直接選擇同一來(lái)源同型粘連模塊組成的支架蛋白，人造纖維小體能像天然纖維小體組裝過(guò)程一樣，纖維素酶的結(jié)合具有隨機(jī)性。Wen等［28］將熱纖梭菌帶有CBD區(qū)域的前3個(gè)I型粘連模塊作為支架蛋白，再把EG II、CBH II及BGL1與熱纖梭菌纖維小體酶組分的對(duì)接模塊融合，在釀酒酵母中共表達(dá)，賦予了釀酒酵母降解PASC的功能，但乙醇產(chǎn)量也只達(dá)到1.87 g/L。其中，三功能纖維小體構(gòu)建過(guò)程中，3種纖維素酶的結(jié)合率都下降了，尤其是CBH II，熒光單位下降了160倍。原因可能是由于4種組分共表達(dá)給細(xì)胞帶來(lái)了一定的代謝負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致支架蛋白的展示量和纖維素酶的分泌量下降;或者由于粘連模塊-對(duì)接模塊相互之間的親和性不同，導(dǎo)致具有較弱親和性的對(duì)接模塊的纖維素酶處于組裝弱勢(shì)，形成纖維素酶種類不完全的纖維小體。人造纖維小體表達(dá)的纖維素酶種類單一，即使使用同一來(lái)源的同型支架蛋白，目前也不能實(shí)現(xiàn)人造纖維小體的多樣化。

使用不同來(lái)源纖維小體的粘連模塊串聯(lián)的雜合支架蛋白，能使纖維小體酶的組裝僅依賴粘連模塊-對(duì)接模塊作用特異性，不需要考慮親和性的強(qiáng)弱。目前，多數(shù)人造纖維小體的設(shè)計(jì)，主要是依賴于粘連模塊-對(duì)接模塊間的相互作用。Tsai等［24］將來(lái)源于熱纖梭菌、解纖維梭菌和黃色瘤胃球菌的粘連模塊串聯(lián)，各個(gè)纖維素酶則融合上相對(duì)應(yīng)來(lái)源的對(duì)接模塊。在釀酒酵母中表達(dá)這個(gè)雜合支架蛋白，纖維素酶能特異性地結(jié)合于支架蛋白上，如熱纖梭菌纖維小體酶組分只能與熱纖梭菌源的粘連模塊組裝，而不能與其他2種來(lái)源的粘連模塊結(jié)合。重組釀酒酵母降解PASC可產(chǎn)生3.5 g/L的乙醇。雜合支架蛋白本身能控制纖維素酶的比例，而組裝過(guò)程中纖維素酶的添加比例并沒有得到控制，可能會(huì)導(dǎo)致某些纖維素酶的過(guò)剩。因此，Tsai等［25］在釀酒酵母中分別單獨(dú)表達(dá)了纖維小體組成單元，通過(guò)對(duì)發(fā)揮不同功能的釀酒酵母共培養(yǎng)，并對(duì)共培養(yǎng)的細(xì)胞比例進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明:當(dāng)骨架蛋白、EG、CBH、BGL 的比例為7∶2∶4∶2時(shí)，發(fā)酵 PASC 生產(chǎn)乙醇的得率比等比例共培養(yǎng)時(shí)提高了2倍。除通過(guò)粘連模塊與對(duì)接模塊之間的相互作用外，Ito等［33］利用抗原抗體反應(yīng)的原理，將金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面抗原A的結(jié)合結(jié)構(gòu)域Z區(qū)作為粘連模塊與EG融合的免疫球蛋白A的Fc區(qū)對(duì)接，同時(shí)，噬纖維梭菌的粘連模塊則與BGL融合的對(duì)接模塊相互作用，將酶特異地組裝在釀酒酵母表面。雖然，雜合支架蛋白的設(shè)計(jì)優(yōu)化了纖維小體本身的纖維素酶組裝比例，但纖維小體各組分在釀酒酵母中表達(dá)時(shí)，由于其天然結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變或其分泌量低，導(dǎo)致了人造纖維小體在釀酒酵母表面的組裝效率很低。

2.3 人造纖維小體復(fù)雜化的設(shè)計(jì)

雖然人造纖維小體已經(jīng)在釀酒酵母表面成功地自組裝，但是其降解纖維素的能力仍然很低。與天然纖維小體相比，人造纖維小體的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、酶組分單一，而纖維小體的復(fù)雜性是其降解高效性的重要影響因素之一。要實(shí)現(xiàn)高效CBP酵母的構(gòu)建，還需要對(duì)釀酒酵母纖維小體進(jìn)行進(jìn)一步的復(fù)雜化和優(yōu)化。首先，復(fù)雜化纖維素酶是較為直接簡(jiǎn)單的方式，可以通過(guò)在釀酒酵母中高效表達(dá)纖維素酶，優(yōu)化酶與酶之間的協(xié)同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。Tsai等［24］比較熱纖梭菌的內(nèi)切葡聚糖酶CelA和解纖維梭菌的內(nèi)切葡聚糖酶CelG發(fā)現(xiàn)，CelA水解CMC的能力高于CelG。Ilmén等［6］則在釀酒酵母中表達(dá)了14個(gè)來(lái)源的 CBH I與11個(gè) CBH II，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的CBH在釀酒酵母中表達(dá)活性相差很大，其中埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)CBHⅠ具有最高酶活，在其C端加上碳水化合物結(jié)合模塊后，促進(jìn)了其對(duì)微晶纖維素(Avicel)的水解能力以及其與具有高活性的Chrysosporium lucknowense的CBH II協(xié)同作用后，大幅度地增加了Avicel的降解作用。雖然，纖維素酶的來(lái)源和酶與酶之間的協(xié)同作用已經(jīng)開始被研究，但是目前纖維小體的酶組分表達(dá)種類卻不超過(guò)3種。另外，增加纖維小體支架蛋白的復(fù)雜度也是一種有效的方式，可以通過(guò)增加支架蛋白的長(zhǎng)度和支架蛋白之間的嵌合使用來(lái)實(shí)現(xiàn)。Fan等［27］模擬熱纖梭菌天然纖維小體的結(jié)構(gòu)(圖1(b))，構(gòu)建了初級(jí)支架蛋白和錨定支架蛋白的兩層支架蛋白。錨定支架蛋白(含有至少2個(gè)Ⅱ粘連模塊結(jié)構(gòu)域)由細(xì)胞壁蛋白展示于酵母細(xì)胞表面，分泌到胞外的初級(jí)支架蛋白通過(guò)其C-端的Ⅱ型對(duì)接模塊對(duì)接到錨定支架蛋白的Ⅱ型粘連模塊上，纖維素酶則由Ⅰ型對(duì)接模塊-粘連模塊組裝到初級(jí)支架上。初級(jí)支架蛋白和錨定支架蛋白嵌合使用，不僅復(fù)雜化了纖維小體的結(jié)構(gòu)，還增加了每個(gè)纖維小體中纖維素酶的數(shù)量。但重組菌株雖然能利用Avicel，但也只能產(chǎn)生1.4 g/L的乙醇。

2.4 釀酒酵母展示系統(tǒng)及分泌途徑的優(yōu)化

纖維素酶和支架蛋白的高效表達(dá)是實(shí)現(xiàn)人造纖維小體高效表達(dá)最基本的要求。影響異源蛋白分泌量的因素包括靶蛋白的特性、宿主細(xì)胞及其培養(yǎng)條件、表達(dá)載體、啟動(dòng)子選擇、密碼子偏好性、信號(hào)肽以及蛋白的加工分泌途徑［34］。其中，蛋白的加工分泌途徑是極其復(fù)雜且重要的影響因素。在胞質(zhì)中翻譯完成的多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，經(jīng)過(guò)ER中的分子伴侶、氧化還原酶和糖基化酶等折疊修飾后通過(guò)膜泡運(yùn)輸至高爾基體，而錯(cuò)誤折疊的蛋白則被識(shí)別，或重新進(jìn)行折疊或運(yùn)回細(xì)胞質(zhì)并通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的降解體系(ER associated degradation，ERAD)降解。運(yùn)至高爾基體(Golgi)中的蛋白進(jìn)一步加工修飾形成成熟蛋白再由膜泡運(yùn)至胞外。當(dāng)錯(cuò)誤折疊蛋白大量積累時(shí)就會(huì)激活非折疊蛋白響應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，通過(guò)調(diào)控一系列分泌途徑相關(guān)基因(包括分子伴侶、蛋白分泌、ERAD等基因)的表達(dá)水平，促進(jìn)折疊錯(cuò)誤的蛋白正確折疊或降解，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)蛋白分泌［35］。釀酒酵母表達(dá)不同來(lái)源的纖維素酶所引起UPR程度各不相同，且共表達(dá)多種蛋白將進(jìn)一步加劇UPR［6］，說(shuō)明大量異源蛋白的表達(dá)可能導(dǎo)致參與酵母分泌途徑中的重要因素如分子伴侶、膜泡運(yùn)輸、糖基化的蛋白因子等的不足。

在釀酒酵母中，由于蛋白折疊在ER中受多種基因的協(xié)同調(diào)控，往往是異源蛋白高效分泌表達(dá)的主要限制因素，因此，超表達(dá)一些分子伴侶、協(xié)助蛋白以及二硫鍵合成的相關(guān)酶類可能是一種提高異源蛋白分泌的簡(jiǎn)單有效策略［36］。如超表達(dá)分子伴侶Hsp70家族的ATPase Kar2p以及它的輔助蛋白(如Sis1p/Sil1p以及Lhs1p)可提高多種異源蛋白的分泌活性［37-38］;超表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶PDI使裂殖酵母的酸性磷酸酶和人類血小板源生長(zhǎng)因子B分別提高了4倍和10倍，且使瑞氏木霉外切葡聚糖酶CBH I在釀酒酵母中分泌酶活提高了17.2%［4，39］;UPR 激活途徑中的轉(zhuǎn)錄因子 Hac1p超表達(dá)后，使酵母自身分泌蛋白蔗糖酶的表達(dá)量提高了2倍，異源 α-淀粉酶表達(dá)量提高了 2.4倍［40］。一般地，異源蛋白在釀酒酵母中表達(dá)都會(huì)因?yàn)檫^(guò)度糖基化，導(dǎo)致分泌酶活的降低。Suzuki等［41］敲除釀酒酵母分泌途徑中多種糖基化修飾相關(guān)基因后，不同程度地提高了纖維素酶與支架蛋白的組裝效率。然而，一些蛋白在ER中正確折疊了，卻仍然有部分滯留在胞內(nèi)，說(shuō)明ER-Golgi或Golgi后期蛋白運(yùn)輸中的一些相關(guān)基因是限制性因素。超表達(dá)參與Golgi形成的囊泡與質(zhì)膜融合的突出融合蛋白Sso1/2使蔗糖酶和淀粉酶的表達(dá)分別提高了6倍和3倍［42］。雖然對(duì)釀酒酵母的分泌途徑進(jìn)行改造能在一定程度上提高蛋白的分泌量，但分泌途徑是一個(gè)完整的通路，如果要更高效地提高異源蛋白的分泌，就需要提高分泌途徑的整體效率。

目前，釀酒酵母人造纖維小體的支架蛋白一般由凝集素Aga錨定于細(xì)胞表面，通過(guò)半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，但該表達(dá)體系有一定的缺陷。首先，支架蛋白的半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程不能實(shí)現(xiàn)真正的CBP途徑;其次，凝集素Aga蛋白由Aga1和Aga2雙亞基組成，所以需要與EBY100細(xì)胞匹配使用，極大地限制了底盤細(xì)胞的改造。酵母細(xì)胞表面展示是把異源靶蛋白與釀酒酵母的載體蛋白融合后，通過(guò)GPI錨定機(jī)制使靶蛋白定位于細(xì)胞表面的表達(dá)系統(tǒng)。用于釀酒酵母表面展示的錨定蛋白有 Aga1p、Cwp1p、Cwp2p、Agα1p、Sed1p、Tip1p、Flo1p、YCR89w 以及Tir1p。以α-半乳糖苷酶為靶蛋白，比較不同展示系統(tǒng)的展示效率發(fā)現(xiàn)，Cwp2p、Aga1p和 Sed1p具有較高的錨定效率，但是Aga1p-α-半乳糖苷酶的總酶活分別比 Cwp2p-α-半乳糖苷酶和 Sed1p-α-半乳糖苷酶低6 倍和 8 倍［43］。Goyal等［30］將 Aga1p 表面展示系統(tǒng)更換為Agα1p表面展示系統(tǒng)，并且將半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子換為釀酒酵母組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PGK后，使支架蛋白的展示效率從60%增加到了85%。所以，優(yōu)化支架蛋白的表面展示也是提高纖維小體展示效率的有效措施之一。

3 人造纖維小體在其他宿主中表達(dá)的研究

天然的纖維小體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，構(gòu)建組分確定的纖維小體嵌合體，可簡(jiǎn)化纖維小體的結(jié)構(gòu)，從而推動(dòng)對(duì)天然纖維小體的研究。最初，為了研究纖維小體各組分的功能特性，F(xiàn)ierobe 等［31，44］在大腸桿菌中成功表達(dá)了微型纖維小體，每個(gè)酶組分能夠特異性地結(jié)合至相應(yīng)粘連模塊上，并且將支架蛋白和酶組分按照化學(xué)計(jì)量數(shù)之比就可以實(shí)現(xiàn)完全對(duì)接。2002年Fierobe等［45］研究發(fā)現(xiàn)支架蛋白上CBM的出現(xiàn)能提高纖維素酶的總活力，且復(fù)合物酶組分的鄰近效應(yīng)能促進(jìn)酶組分之間的協(xié)同作用。丙酮丁醇梭菌是生產(chǎn)具有重要工業(yè)價(jià)值產(chǎn)品——丁醇的菌株，其基因組內(nèi)含有纖維小體基因，但是利用纖維素的能力非常弱。所以根據(jù)其自身帶有的纖維小體相關(guān)基因進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，賦予其利用纖維素生產(chǎn)丁醇的能力也越來(lái)越受關(guān)注［46-47］。為了提高丙酮丁醇梭菌的纖維素利用能力，Perret等［46］在丙酮丁醇梭菌中表達(dá)了異源支架蛋白，但是還沒有實(shí)現(xiàn)纖維素酶與支架蛋白的組裝。此外，枯草芽胞桿菌自身能夠表達(dá)半纖維素酶，并且能利用可溶性的戊糖和己糖(如葡萄糖、木糖以及纖維二糖)，但是卻不能以纖維素原料作為唯一C源生長(zhǎng)。Murashima等［48］構(gòu)建了來(lái)源于嗜纖維梭菌的微型支架蛋白miniCbpA，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶EngB對(duì)接到枯草芽胞桿菌表面的支架蛋白上。Arai等［49］將嗜纖維梭菌的EngB、XynB及微型支架蛋白miniCbpA分別在枯草芽胞桿菌中單獨(dú)表達(dá)，共表達(dá)過(guò)程自組裝形成纖維小體。

4 展望

目前，釀酒酵母人造纖維小體的研究還處于初級(jí)階段，很多問題并未得到解決，如支架蛋白的展示效率較低、纖維素酶組分單一、纖維小體各組分在釀酒酵母中表達(dá)量及表達(dá)活性不足、體外組裝效率低等。為了提高釀酒酵母纖維小體對(duì)纖維素的降解能力，從提高釀酒酵母纖維素酶和支架蛋白的分泌能力以及優(yōu)化微型纖維小體設(shè)計(jì)等方面著手，構(gòu)建高效的纖維小體嵌合體。例如，篩選可在酵母中實(shí)現(xiàn)高活性表達(dá)的纖維素酶以及采用高效的表面展示系統(tǒng)提高支架蛋白的表面展示;或者通過(guò)釀酒酵母自身分泌途徑的相關(guān)改造，提高纖維素酶和支架蛋白的分泌。另外，在3種纖維素酶協(xié)同作用的基礎(chǔ)上，增加纖維素酶的種類及數(shù)量，構(gòu)建多層支架蛋白，也可以達(dá)到優(yōu)化纖維小體的設(shè)計(jì)的目的。高效CBP酵母的構(gòu)建，是提高木質(zhì)纖維素資源的轉(zhuǎn)化能力的有效方式之一，因此，高效釀酒酵母纖維小體嵌合體的構(gòu)建對(duì)于推動(dòng)纖維素資源的利用有著重要意義。

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