潘佳偉，閆 雨，尹 芹，楊小清，韓 偉，2

(1.華東理工大學 藥學院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海 200237;2.上海市新藥設計重點實驗室，上海 200237)

首烏藤，別名夜交藤，是蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥藤莖。其性甘微苦、平，具有祛風通絡、養(yǎng)血安神等功效［1］，常用于治療失眠多夢、血虛身痛、風濕痹痛等［2］多種病癥。目前，對于首烏藤化學成分方面的研究主要集中于其中的蒽醌類［3］(如大黃素)、茋類［4］以及黃酮類成分。

黃酮類化合物是植物次生代謝產物，以游離態(tài)或與糖結合為苷的形式存在［5］。作為一種很強的抗氧化劑，它既能有效阻止細胞的退化、衰老，又可在一定程度上防止癌癥的發(fā)生。此外，還具有降低血脂，抑制炎性生物酶的滲出，增進傷口愈合和止痛等藥理作用［6］。首烏藤莖中的黃酮組分具有清除·OH和·O－2的能力［7］。

表面活性劑分子可增加大分子有機物質的溶解滲出能力［8］，目前已經被初步應用于天然產物的提取中。在中藥提取中，加入合適、適量的表面活性劑，既可以實現(xiàn)水提操作、縮短浸潤時間、提高提取效率，又能避免使用高成本的有機溶劑，減少重污染的發(fā)生［9］。

本文中筆者選取首烏藤為研究體系，采用表面活性劑輔助的方法提取首烏藤中的總黃酮，通過優(yōu)化該方法的提取工藝，以期提高首烏藤中總黃酮的得率，為后續(xù)試驗提供理論和數(shù)據(jù)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要原料與試劑

首烏藤飲片(去葉)，上海華鷹藥業(yè)有限公司(批號:HY2013060303，產地:安徽);蘆丁對照品(批號:20130619)，上海金穗生物科技有限公司;NaNO2、NaOH和十二烷基硫酸鈉(SDS)(化學純)，上海凌峰化學試劑有限公司;Al(NO3)3(化學純)，上海新寶精細化工廠;吐溫-20、吐溫-60、吐溫-80和司班-60(化學純)，國藥集團化學試劑有限公司;去離子水，自制。

1.1.2 主要儀器設備

UV1900PC型紫外分光光度計，上海市亞研電子公司;JA31002型電子天平，上海市天平儀器廠;DF101-S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司;移液管、容量瓶、量筒等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備

取5.00 g首烏藤飲片置于500 mL圓底燒瓶中，按照一定的液固比加入相應體積的去離子水，并加入一定質量的表面活性劑，固定磁力攪拌功率，水浴加熱至一定溫度后，維持一定時間。結束后，靜置冷卻至常溫，用紗布過濾，濾液作為供試品溶液待測。

1.2.2 分析方法

參考《中國藥典》規(guī)定的黃酮含量分析方法［10］，以蘆丁為標準品，用 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法進行供試品溶液中總黃酮含量的測定。精密稱取干燥至恒質量的蘆丁對照品10 mg，置于50 mL容量瓶內，用體積分數(shù)30%的乙醇溶解并稀釋至刻度，即得蘆丁對照品溶液。將對照品溶液與供試品溶液置于紫外可見分光光度計下，于400～700nm的波長范圍內進行掃描，確定首烏藤總黃酮的最大吸收波長為492 nm。然后精確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0 mL 蘆丁對照品溶液置于25 mL容量瓶中，順序加入質量分數(shù)5%的NaNO2溶液1.0 mL(搖勻，放置6 min)、質量分數(shù)10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL(搖勻，放置6 min)、質量分數(shù)10%的NaOH溶液10.0 mL，補加去離子水至刻度，搖勻，靜置15 min后，以不含蘆丁標準液為空白，在492 nm處測定吸光度(A492)。

以吸光度(A492)對總黃酮質量濃度(ρ)作回歸處理得標準曲線方程A=13.025ρ+0.006 6，線性質量濃度范圍為0.008～0.064 mg/mL;相關系數(shù)R2=0.999 1，表明具有良好的線性關系。通過系統(tǒng)穩(wěn)定性實驗，發(fā)現(xiàn)該分析方法精密度、重現(xiàn)性和顯色穩(wěn)定性均良好。

1.2.3 首烏藤中總黃酮含量的測定方法

取2.0 mL供試品溶液于25 mL容量瓶中，參照1.2.2在492 nm處測定吸光度，使用1.2.2中標準曲線方程計算得到總黃酮質量濃度，按照下式計算總黃酮得率。

式中:ρ為總黃酮質量濃度，mg/mL;V為溶劑量，mL;m為首烏藤的質量，g;n為溶液稀釋倍數(shù)。

2 結果與討論

2.1 提取工藝單因素的考察

2.1.1 表面活性劑種類對總黃酮得率的影響

常用表面活性劑分為離子型和非離子型，由于結構的不同，對于同一種物質的提取而言，效果也有差異。選取司班-60、SDS、吐溫-20、吐溫-60和吐溫-80作為對象，考察表面活性劑種類對首烏藤中總黃酮得率的影響，結果如圖1所示。

圖1 表面活性劑對總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of surfactant on the yield of total flavonoids

由圖1可知:在表面活性劑質量濃度3 g/L、液固比20 mL/g、提取溫度70℃、加熱時間0.5 h的情況下，使用SDS作為表面活性劑提取得率最高，且SDS價格低廉，因而選擇SDS作為實驗所用的表面活性劑。

2.1.2 SDS質量濃度對總黃酮得率的影響

圖2為考察不同的SDS質量濃度對首烏藤總黃酮得率的影響結果。

圖2 SDS質量濃度對總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of SDS concentration on the yield of total flavonoids

由圖2可知:在液固比20 mL/g、提取溫度70℃、加熱時間0.5 h相同的情況下，在實驗范圍內，SDS質量濃度與得率存在正相關的關系。在較低質量濃度下，由于未達到臨界膠束濃度，總黃酮得率隨SDS質量濃度的增大而增加，達到臨界膠束濃度后，SDS在飲片表面吸附達到極值，總黃酮得率提升不再顯著，而過多的表面活性劑會造成浪費，故選擇SDS的最佳質量濃度為3 g/L。

2.1.3 液固比對總黃酮得率的影響

對于傳質而言，傳質速率的大小與傳質推動力的大小有關。圖3為液固比對總黃酮得率的影響關系圖。

由圖3可以看出:在選定的實驗范圍內，隨著液固比的升高，總黃酮得率逐漸上升，這是因為增加液固比能提高提取過程的傳質推動力。當液固比超過30 mL/g后，由于溶劑量的增大，使得加熱效果等因素受到干擾，總黃酮得率上升趨勢不明顯。同時，過高的液固比在實際的生產操作中會增加處理量和能耗，使生產效率降低。因此最終液固比為30 mL/g。

2.1.4 提取溫度對總黃酮得率的影響

溫度是微觀粒子熱運動的宏觀表現(xiàn)，對提取效果存在影響。通過設置提取溫度為65、70、75、80、85和90℃進行6組實驗，考察提取溫度對總黃酮得率的影響，結果見圖4。

圖3 液固比對總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of liquid to solid ratio on the yield of total flavonoids

圖4 提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of extracting temperature on the yield of total flavonoids

由圖4可知:隨著溫度的升高，總黃酮得率呈上升趨勢。在溫度為75℃時，得率增長率較低，可能是在此溫度下膠束結構達到平衡。溫度突破75℃后，該平衡被打破，溫度的升高會成為影響得率的顯著因素，直至溫度超過85℃再次達到平衡。綜合能耗等因素，選取80℃為提取溫度。

2.1.5 加熱時間對總黃酮得率的影響

加熱時間的長短將影響表面活性劑的提取效果。時間太短會使浸潤、提取不完全，導致表面活性劑增溶效果減弱;而時間較長，不僅能耗增加，還會增加其他成分的溶出，增加后續(xù)純化分離的成本。圖5考察了不同加熱時間對總黃酮得率的影響。

由圖5可以看出:隨著加熱時間的延長，液固接觸時間增多，有利于傳質的進行，總黃酮得率上升。在2.5 h時，得率達到最大值。當加熱時間超過2.5 h后黃酮得率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是加熱時間過長導致部分黃酮分解所致，因而加熱時間選取2.5 h為宜。

圖5 加熱時間對總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of heating time on the yield of total flavonoids

2.2 正交試驗設計

在單因素試驗結果分析的基礎上，選取其主要影響因素進行正交試驗設計。通過對試驗結果的分析，確定首烏藤總黃酮的最佳提取工藝條件，并進行重現(xiàn)性驗證。

以提取溫度、加熱時間、液固比為考察因素，每個因素考察3個水平，按照正交試驗L9(33)表設計正交試驗。因素水平表見表1，正交試驗結果和分析表見表2和表3。

由表3的極差數(shù)據(jù)分析可見，各因素對首烏藤總黃酮得率的影響從大到小依次為:加熱時間、提取溫度、液固比。結合單因素試驗與正交試驗得到優(yōu)化工藝條件得出:SDS質量濃度3 g/L，液固比40 mL/g，提取溫度90℃，加熱時間2.5 h。在此條件下，進行 3次平行實驗，總黃酮得率平均值為6.1%。對比正交試驗結果，可見該工藝結果較好，且具有較好的穩(wěn)定性。

表1 正交試驗的因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiments

表3 正交試驗分析Table 3 Analysis of orthogonal experiments

2.3 對照實驗結果

除本實驗方法外，常用的中藥提取方法包括:熱回流提取法、超聲協(xié)同提取法［11］、微波提取法［12］和索氏提取法。

筆者設計了對照實驗，實驗方案與結果見表4。其中，SDS輔助提取法(Ⅱ)采取最佳工藝條件進行;在實際工業(yè)生產中，一般考慮選取較小的液固比、藥渣重復提取的方法，故將 SDS輔助提取法(Ⅰ)與最佳工藝進行對比，發(fā)現(xiàn)總黃酮得率相差不大，故確定以30 mL/g的液固比進行對比試驗。

表4結果表明:表面活性劑輔助提取法得率最高，能顯著提高首烏藤總黃酮的提取效率，避免高濃度有機溶劑的使用，更加綠色環(huán)保。因此，SDS輔助提取法在提高總黃酮得率方面有較大的優(yōu)勢，是較為理想的一種提取工藝。

表4 對比實驗結果Table 4 Contrast experiment results

3 結論

采用表面活性劑輔助提取首烏藤中的總黃酮，考察了表面活性劑種類和濃度、提取溫度、液固比、加熱時間等因素對得率的影響，并通過正交試驗設計優(yōu)化工藝參數(shù)，結合對照實驗，最終確定最優(yōu)工藝條件:表面活性劑SDS質量濃度為3 g/L，液固比30 mL/g，提取溫度90℃，加熱時間2.5 h。

在最優(yōu)工藝條件下，總黃酮得率為6%。該方法具有能耗低、時間短、得率高的特點。

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