宋 波,侯怡鈴,丁 祥
(西華師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,南充 637002)
多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一類在環(huán)境中廣泛分布的有機(jī)污染物,其性質(zhì)穩(wěn)定、殘留時間長,是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的化學(xué)致癌物[1],已被多個國家列為優(yōu)先控制污染物。PAHs在環(huán)境中普遍存在,具有致誘變性,而且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,難以降解等特點(diǎn)。目前,治理PAHs污染的方法主要以生物修復(fù)為技術(shù)。以微生物代謝作用為主的生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、效果好、無二次污染等優(yōu)點(diǎn),是目前PAHs污染土壤修復(fù)最具有潛力的修復(fù)手段之一[2-3]。但是采用傳統(tǒng)的微生物降解手段耗時較長,借助外加電場等技術(shù)加速菲的降解顯得尤為重要[4-5]。
對微生物細(xì)胞施加外加電場如弱電流在液相或泥漿體系中激發(fā)電極反應(yīng)能刺激微生物的生長和代謝作用[6],已成功應(yīng)用于酵母菌的發(fā)酵[7]、生物脫氮[8]以及鐵細(xì)菌[9]電化學(xué)培養(yǎng)等過程。微生物電解技術(shù)是電化學(xué)與生物工程交叉領(lǐng)域的一個重要課題,近年來受到研究者日益增長的關(guān)注。目前該技術(shù)已在工業(yè)微生物培養(yǎng)和環(huán)境微生物電刺激修復(fù)[7-8]兩方面顯示出良好的前景,為未來利用外加電場強(qiáng)化于微生物反應(yīng)的生物化工及環(huán)境化工過程提供了一個新的趨勢。鑒于此,筆者以從石油污染土壤分離得到的細(xì)菌Enterobacter dissolvens為實(shí)驗(yàn)對象,以菲為唯一C源,由于菲在水中的溶解度較低,通過添加吐溫80促溶,使菲在水中的溶解度有明顯的提高[10]。綜合考察在外加電場下,利用直流電(DC)和交流電(IC)條件下,該細(xì)菌在生長、活性以及菲的降解率等方面的影響,旨在為利用微生物修復(fù)土壤環(huán)境中多環(huán)芳烴污染提供理論與實(shí)踐依據(jù)。
所用的菌種篩選自天津大港油田油污染水中,并以菲為唯一C源進(jìn)行馴化。經(jīng)16s rDNA測序后鑒定該菌為Enterobacter dissolvens屬革蘭氏陰性腸桿菌。
采用無機(jī)鹽類(g/L):MgSO40.25、FeSO4·7H2O 0.01、CaCl20.032、K2HPO40.8、KH2PO40.2、NH4NO30.8;由于菲難溶,故添加吐溫80作為增溶劑,質(zhì)量濃度分別為3.2和1 000 mg/L。
參考Luo等[11]報(bào)道電刺激多采用對數(shù)期的細(xì)菌作為研究對象,首先對細(xì)菌溶液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),以保持細(xì)菌液具有較高的活性。預(yù)培養(yǎng)條件:首先從-80℃低溫冰箱中保存的甘油管中取出0.1 mL種子菌液,接種至盛有50 mL經(jīng)過濾滅菌含培養(yǎng)基的三角瓶中,30℃恒溫?fù)u床(150 r/min)中培養(yǎng)約10 h,此時所得的細(xì)菌的生長處于對數(shù)生長期初期,菌體濃度(OD600)在0.2至0.3之間。
1.4.1 細(xì)菌濃度測定
測量600 nm波長處的吸光度值(OD600)。
1.4.2 細(xì)胞脫氫酶活測定
采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)顯色法測定細(xì)胞脫氫酶活[12]。
1.4.3 氧化還原電位測定
采用 Pt4865-50-S7,氧化還原電極(Mettler Toledo公司)測定氧化還原電位(ORP)。
1.4.4 菲的測定
由于菲不溶于水,采用正己烷將溶液中的菲萃出。萃取出液相時,1 mL樣品溶液中加入1mL正己烷,劇烈振蕩1 min后離心,取上層有機(jī)相。采用Shimadu LC-10AT(Shimadu公司)高壓液相色譜配合C18反相柱測定有機(jī)相中菲的濃度。檢測方法為紫外法(UV),檢測波長為254 nm,流動相為甲醇-水溶液(兩者體積比為 90∶10),流速 180 mL/min。采用外標(biāo)法測定菲的濃度。
1.4.5 吐溫80的分析
采用硫氫酸銨鈷顯色法測定吐溫80[13]。
參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行電刺激實(shí)驗(yàn)。
脫氫酶是細(xì)胞胞內(nèi)呼吸鏈上一組重要酶系的統(tǒng)稱,其活性高低表明了細(xì)胞從葡萄糖底物上獲取質(zhì)子和電子以供應(yīng)細(xì)胞代謝活動的能力,也常用于表征微生物細(xì)胞的總體代謝活力,而且能直接表示生物細(xì)胞對其基質(zhì)降解能力的強(qiáng)弱。為考察直流電和交流電對細(xì)菌E.dissolvens生長及活性的電解刺激效果,在實(shí)驗(yàn)中采用測定細(xì)菌脫氫酶的方法來反映細(xì)菌的活性[15]。為研究外加電場對E.dissolvens在生長和底物代謝兩方面的影響,在10 mA電流條件下采用鉑電極分別對預(yù)培養(yǎng)菌液進(jìn)行了直流電和交流電刺激,同時監(jiān)測實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞脫氫酶活(DHA)、菲和吐溫80的降解速率以及生長曲線三方面的變化,結(jié)果如圖1和圖2所示。
由圖1可知:隨著加電時間的延長,細(xì)菌脫氫酶活性逐漸增強(qiáng),菌液中細(xì)胞的生長濃度也逐漸增加。與參比值相比,可以明顯看出加電后細(xì)菌的生長和脫氫酶活得到顯著提升。由圖2可知:加電后吐溫80和菲的濃度也有著顯著的變化。與參比值相比,2種C源的消耗均有所加快,尤其是在直流電條件下,吐溫80的降解速率較參比增長了1倍,在降解后的8 h,DC刺激下的殘余菲的量為2.25,而對照組的殘余菲的量為2.68。很明顯在DC刺激下菲的降解速率是對照組的1.6倍。根據(jù)在無菌培養(yǎng)基中進(jìn)行電解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用相同條件下的10 mA電流不會導(dǎo)致培養(yǎng)基中菲發(fā)生明顯的電化學(xué)降解(數(shù)據(jù)未顯示)。因此,綜合考慮細(xì)胞菌濃和脫氫酶活同時增長的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象,加電菌液中菲的生物降解速率得到加快。此結(jié)果與筆者在以葡萄糖為唯一底物的培養(yǎng)基體系中的電解實(shí)驗(yàn)相似。這表明電解刺激方法的確可以強(qiáng)化細(xì)胞對底物的代謝,而在“表面活性劑-多環(huán)芳烴”的生物修復(fù)體系中具有應(yīng)用潛力。
圖1 外加電場對菲降解菌生長及脫氫酶活性的影響Fig.1 Effects of external electric field on dehydrogenase activity and cell growth of E.dissolvens
圖2 外加電場對菲降解菌及吐溫80的影響ig.2 Effects of external electric field on the phenanthrene and Tween 80 in E.dissolvens broth
為了考察加電電場(ORV)對細(xì)胞菌液理化性質(zhì)的影響,因此測定了細(xì)菌溶液的氧化還原電位(ORP)值和pH,結(jié)果見圖3。
圖3 外加電場對細(xì)胞溶液的氧化還原電位和pH的影響Fig.3 Effects of the external electric field on ORP and pH in the E.dissolvens culture broth
由圖3可知:菌液的理化性質(zhì)隨著外加電場的施加,溶液的氧化還原電位急劇下降,尤其是直流電在加電的1 h就達(dá)到-580 mV,交流電刺激后為-230 mV,而參比值僅為100 mV,并在整個培養(yǎng)周期內(nèi)顯著低于參照菌液。由圖3可以看出:溶液的pH隨著細(xì)胞的生長代謝逐漸下降,原因可能是在細(xì)胞生長的后期菌液出現(xiàn)一定程度的酸化現(xiàn)象。而加電后溶液的pH略低于參比值,并且在整個加電過程中pH的變化很小。這一結(jié)果與佘鵬等[14]、許曉路等[15]對以葡萄糖為唯一 C 源的培養(yǎng)物體系的電解刺激作用結(jié)果相似,加電后細(xì)胞的脫氫酶活、底物降解及細(xì)胞的生長顯著提高。在菌液物化性質(zhì)上,加電后菌液的氧化還原電位明顯下降。這極有可能是陰極水電解反應(yīng)所生產(chǎn)的H2導(dǎo)致了溶液氧化還原電位的急劇下降[16]。這正是菌液中長期保持有氧狀態(tài)的強(qiáng)還原性環(huán)境的原因,從而促進(jìn)了菲降解菌的生長和代謝。
研究表明,外加電場對菲的降解有明顯的促進(jìn)作用。低電流刺激下,施加直流電能促進(jìn)菲降解細(xì)菌的生長和代謝,對菲的降解效果明顯。交流電的刺激效果沒有直流電的刺激效果明顯,可能是直流電和交流電電極反應(yīng)產(chǎn)物的不同所造成的。因此,用微生物電解刺激降解多環(huán)芳烴污染是一種綠色可行的環(huán)保方法。電刺激技術(shù)是一個很復(fù)雜的體系,但是這一結(jié)果有助于加深對微生物電解刺激技術(shù)的認(rèn)識,為以后的應(yīng)用提供廣闊的前景。
[1] 何麗娟,李正華,洪青,等.一株菲降解菌的特性及相關(guān)降解基因的克?。跩].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2009,15(5):682-685.
[2] 楊秀虹,湯婉環(huán),李適宇.一株菲降解菌的生長特性及其對熒蒽和芘的降解能力[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,51(l):107-121.
[3] 劉其友,盧磊,趙東風(fēng),等.一株菲降解茵的分離鑒定及其降解條件研究[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2010,19(11):2652-2656.
[4] 馬建偉,王慧,羅啟仕.電動力學(xué)作用下土壤中菲的遷移特征及其機(jī)理[J].中國環(huán)境科學(xué),2007,27(2):241-245.
[5] 馬莉,張國慶,曾彩明.化學(xué)強(qiáng)化劑在電動修復(fù)技術(shù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展,2008,27(1):38-44.
[6] 宋波,佘鵬,劉錚.微生物電解刺激技術(shù)及其在生物化工和環(huán)境生物技術(shù)中的應(yīng)用[J].化工進(jìn)展,2006,25(1):39-42.
[7] Nakanishi K,Tokuda H,Soga T,et al.Effect of electric current on growth and alcohol production by yeast cells[J].J Ferment Bioeng,1998,85(2):250-253.
[8] Beschkov V,Velizarov S,AgathosS N,etal.Bacterial denitrification of waste water stimulated by constant electric field[J].Biochem Eng J,2004,17(2):141-145.
[9] Matsumoto N,Nakasono S,Ohmura N,et al.Extension of logarithmic growth ofThiobacillusferrooxidansby potential controlled electrochemical reduction of Fe(III)[J].Biotechnol Bioeng,1999,64:716-721.
[10] 龍濤,劉翔,楊建剛,等.非離子型表面活性劑吐溫80增溶條件下菲的生物降解[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2003,4(5):1-4.
[11] Luo Q,Wang H,Zhang X,et al.Effect of direct electric current on the cell surface properties of phenol-degrading bacteria[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(1):423-427.
[12] 宋波.溶解腸桿菌的交流電電解刺激過程[J].生物技術(shù)通報(bào),2009(3):123-126.
[13] 沈琦,陳繼亭,劉大英.凝血因子制品中Tween 80殘留量測定方法的研究[J].中國生物制品學(xué)雜志,1999(12):111-113.
[14] 佘鵬,宋波,邢新會,等.細(xì)菌Enterobacter dissolvens的直流電解刺激過程[J].過程工程學(xué)報(bào),2006,6(1):71-76.
[15] 許曉路,申秀英.活性污泥活性參數(shù)指標(biāo)的選評[J].環(huán)境科學(xué),1993,14(2):58-62.
[16] Sanetaka S,Shigeru K,Mariko N,et al.Electrolyzed-reduced eater scavenges active oxygen species and protects DNA from oxidative damage[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,234(1):269-274.