張 幟，李理想，馬翠卿

(山東大學(xué) 微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

2，3-丁二醇(2，3-butanediol，2，3-BD)是一種 C4平臺(tái)化合物，被廣泛應(yīng)用于食品、化工和航空航天燃料等領(lǐng)域，它可直接用作增濕劑、軟化劑和風(fēng)味添加劑等，也可用來制備聚合物、油墨、香水、熏蒸劑、增塑劑、炸藥以及藥物的手性載體等［1-5］。2，3-丁二醇的燃燒值為27 200 kJ/kg，與乙醇(29 055 kJ/kg)和甲醇(22 081 kJ/kg)相當(dāng)，是一種潛在價(jià)值很高的燃料添加劑［6］。如(2R，3R)-2，3-丁二醇由于具有較低的凝固點(diǎn)(-60℃)，因此可以作為抗凍劑［2，7］，而 meso-2，3-丁 二 醇 還 可 用 于 聚 合 物 的生產(chǎn)［8］。

2，3-丁二醇的衍生物也具有重要用途。例如，2，3-丁二醇在脫氫酶的作用下生成的3-羥基丁酮，是一種常用的香料，用作奶油、干酪、咖啡和果實(shí)的香味增強(qiáng)劑［9］;2，3-丁二醇脫水產(chǎn)物甲乙酮，是一種優(yōu)良的有機(jī)溶劑，在膠黏劑、合成革、油墨和涂料等工業(yè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用［2，5］;2，3-丁二醇脫水產(chǎn)生的1，3-丁二烯，可用于合成樹脂和橡膠等;2，3-丁二醇與甲乙酮縮合并進(jìn)行加氫反應(yīng)生成的辛烷，可用來產(chǎn)生高質(zhì)量的航空燃料［2，5］。目前，2，3-丁二醇及其衍生物的市場需求據(jù)估計(jì)可達(dá)到每年3 000萬t以上，其市場價(jià)值高達(dá)430 億美元［10］。

芽胞桿菌屬(Bacillus)微生物是革蘭氏染色陽性菌，具有產(chǎn)生芽胞、需氧或兼性厭氧的特性。芽胞桿菌由于能夠產(chǎn)生芽胞，具有較強(qiáng)的環(huán)境抗逆性;同時(shí)，芽胞桿菌具有較強(qiáng)的C源利用能力，可利用包括葡萄糖、果糖和木糖等單糖，蔗糖和纖維二糖等二糖以及淀粉等復(fù)雜C源，因此，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)乳酸、聚谷氨酸和乙偶姻等化學(xué)品［9，11-12］。目前，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)、多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)和淀粉液化芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)，被用于 2，3-丁二醇的生產(chǎn)研究。本文中，筆者綜述近年來利用芽胞桿菌進(jìn)行2，3-丁二醇生產(chǎn)的研究進(jìn)展，并對其研究方向進(jìn)行展望。

1 芽胞桿菌發(fā)酵2，3-丁二醇能力對比

芽胞桿菌廣泛分布于土壤、水體和空氣中。芽胞桿菌與其他細(xì)菌相比，具有生長繁殖迅速、代謝快、體積大、生命力頑強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。芽胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)2，3-丁二醇的研究已有很多年的歷史［5］，目前已有報(bào)道的產(chǎn)2，3-丁二醇的菌株主要包括多粘類芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、地芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌，這些菌株屬于非致病性芽胞桿菌，被認(rèn)為是GRAS(generally recongnized as safe)細(xì)菌。各菌株特點(diǎn)及產(chǎn)2，3-丁二醇能力見表1。

1.1 多粘類芽胞桿菌

多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)是目前研究較多的2，3-丁二醇生產(chǎn)菌株。其早期在分類學(xué)上歸為芽胞桿菌屬，且由于其在形態(tài)特征、生理生化特征、發(fā)酵特性等很多方面與芽胞桿菌類似，因此，本文中筆者將其與其他芽胞桿菌一起進(jìn)行比較。

表1 利用芽胞桿菌進(jìn)行2，3-丁二醇生產(chǎn)的研究Table 1 Researches for production of 2，3-BD by Bacillus sp.

多粘芽胞桿菌是目前報(bào)道的唯一一種可產(chǎn)光學(xué) 純 (2R，3R)-2，3-丁 二 醇 的 野 生 菌 株。Nakashimada等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在厭氧條件下，pH 6.3、稀釋率為0.2 h-1時(shí)，(2R，3R)-2，3-丁二醇的光學(xué)純度大于98%，其最高產(chǎn)量為74.4 mmol/L。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，添加乙酸可以促進(jìn)多粘芽胞桿菌產(chǎn)2，3-丁二醇。在初始pH 6.8條件下，補(bǔ)料分批發(fā)酵中按照每摩爾葡萄糖中添加0.35 mol乙酸的量添加乙酸，2，3-丁二醇產(chǎn)量可達(dá)637 mmol/L，其光學(xué)純度大于98%，轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的81%［25］。H??ler等［17］研究發(fā)現(xiàn)多粘芽胞桿菌 DSM 365 具有較高的(2R，3R)-2，3-丁二醇生產(chǎn)能力，在60 g/L酵母粉條件下，補(bǔ)料分批發(fā)酵 54 h，(2R，3R)-2，3-丁二醇產(chǎn)量達(dá)到111.0 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到 2.1 g/(L·h)，這是目前多粘芽胞桿菌生產(chǎn)2，3-丁二醇的最高水平。

多粘芽胞桿菌也可利用戊糖為底物發(fā)酵產(chǎn)2，3-丁二醇。Laube等［26］對比了10株多粘芽胞桿菌的木糖利用能力，發(fā)現(xiàn)菌株9035具有較高的利用木糖產(chǎn)2，3-丁二醇的能力，其利用木糖可產(chǎn)生4.4 g/L 2，3-丁二醇，相同條件下其利用L-阿拉伯糖可產(chǎn)生8.7 g/L 2，3-丁二醇。該菌株還可分別利用甘露糖、半乳糖、纖維二糖和淀粉產(chǎn)生 7.3、8.5、8.5 和 5.0 g/L的2，3-丁二醇，表明該菌株具有較廣的底物譜。Marwoto等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在39℃條件下多粘芽胞桿菌批次發(fā)酵24 h可消耗100 mmol/L的木糖，共計(jì)產(chǎn)生39 mmol/L 的(2R，3R)-2，3-丁二醇，同時(shí)還生產(chǎn)了65 mmol/L的乙醇和47 mmol/L的乙酸。而當(dāng)?shù)孜餅?00 mmol/L葡萄糖和100 mmol/L木糖的混合物時(shí)，菌株仍能在24 h內(nèi)消耗完糖，產(chǎn)生82 mmol/L 的(2R，3R)-2，3-丁二醇、124 mmol/L乙醇和33 mmol/L乙酸。以上結(jié)果表明，與葡萄糖相比，多粘芽胞桿菌利用戊糖能力較弱。

菊粉是一種主要由果糖聚合而成的鏈狀非消化性寡糖，其來源于非糧原料菊芋。由于多粘類芽胞桿菌可以產(chǎn)生菊粉酶，因此其可以直接以菊粉為底物進(jìn)行2，3-丁二醇的發(fā)酵生產(chǎn)。Gao等［18］優(yōu)化了多粘類芽胞桿菌利用菊粉發(fā)酵產(chǎn)2，3-丁二醇的培養(yǎng)基，研究發(fā)現(xiàn)菊粉、K2HPO4和NH4Cl是影響2，3-丁二醇發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素，并通過中心組合實(shí)驗(yàn)得到了各因素的最適濃度。在5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，(2R，3R)-2，3-丁二醇的質(zhì)量濃度達(dá)到36.92 g/L，光學(xué)純度大于98%。

1.2 枯草芽胞桿菌

枯草芽胞桿菌(B.subtilis)是芽胞桿菌屬的一種呈革蘭氏染色陽性的菌，該菌能利用多種糖類以及淀粉，能利用蛋白質(zhì)，分解色氨酸形成吲哚。在工業(yè)上，枯草芽胞桿菌是重要的α-淀粉酶、中性蛋白酶和5'-核苷酶生產(chǎn)菌株，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。與地衣芽胞桿菌類似，枯草芽胞桿菌及其生產(chǎn)的酶制劑被美國FDA認(rèn)定為GRAS(generally recognized as safe)，菌體本身在污水處理和生物菌肥行業(yè)中廣泛應(yīng)用?？莶菅堪麠U菌(最廣泛應(yīng)用的菌株為枯草芽胞桿菌168)作為芽胞桿菌屬的模式菌株，已經(jīng)測序獲得多個(gè)菌株的全基因組信息，其遺傳操作體系也是芽胞桿菌屬內(nèi)最成熟，應(yīng)用最廣泛的。早在20世紀(jì)40年代，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生2，3-丁二醇，但是相關(guān)報(bào)道很少。Biswas等［13］報(bào)道了1株枯草芽胞桿菌168的工程菌能夠增加2，3-丁二醇的發(fā)酵生產(chǎn)能力，采用AlsSD操縱子的啟動(dòng)子PalsSD替換budA基因的啟動(dòng)子，使菌株能夠在對數(shù)生長前期表達(dá)budA基因，經(jīng)過基因工程改造后的菌株開始積累2，3-丁二醇的時(shí)間由對數(shù)后期提前到對數(shù)前期，通過添加乙酸鹽，采用好氧-厭氧兩步發(fā)酵法等策略使菌株生產(chǎn)強(qiáng)度提高6.7倍，達(dá)到 0.4 g/(L·h)，2，3-丁二醇的最終總質(zhì)量濃度達(dá)到6.1 g/L。枯草芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的構(gòu)型以(2R，3R)-丁二醇為主。

1.3 淀粉液化芽胞桿菌

淀粉液化芽胞桿菌近年來被發(fā)現(xiàn)是較好的2，3-丁二醇生產(chǎn)菌株。Yang等［14］篩選到1株產(chǎn)2，3-丁二醇的淀粉液化芽胞桿菌B10-127，該菌株能夠在200 g/L的葡萄糖培養(yǎng)基中生長并生產(chǎn)2，3-丁二醇，顯示出較高的葡萄糖耐受性。該菌株的最適發(fā)酵溫度為37℃，最適初始pH在5.5～7.5之間，其補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)92.3 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.96 g/(L·h)。該菌株的轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的84%，主要副產(chǎn)物為琥珀酸。進(jìn)一步的研究表明:玉米漿、豆粕和檸檬酸銨是影響該菌株發(fā)酵產(chǎn)2，3-丁二醇的關(guān)鍵因素，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了以上因素的最適濃度，在最優(yōu)培養(yǎng)基中，該菌株的產(chǎn)量提高至 62.7 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度提高至 1.49 g/(L·h)，是原有水平的2.4倍。當(dāng)發(fā)酵體積放大到20 L后，發(fā)酵 36 h，2，3-丁二醇的終質(zhì)量濃度達(dá)到 61.4 g/L，其生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到1.71 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的76%［15］。該菌株還能夠利用甘油作為發(fā)酵底物進(jìn)行2，3-丁二醇的生產(chǎn)。研究結(jié)果表明，粗甘油的發(fā)酵特性與純甘油接近，且不抑制菌體生長。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，添加葡萄糖或者蔗糖能夠顯著促進(jìn)甘油利用和2，3-丁二醇生產(chǎn)的速率，但其中葡萄糖對甘油的利用有抑制作用，而蔗糖沒有抑制甘油的利用，其促進(jìn)甘油利用和2，3-丁二醇生產(chǎn)的效果更為顯著。在此基礎(chǔ)上，Yang［16］利用富含蔗糖的甜菜糖蜜作為共代謝底物，補(bǔ)料分批發(fā)酵96 h，2，3-丁二醇產(chǎn)量達(dá)到83.3 g/L，轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的84%，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.87 g/(L·h)，為目前報(bào)道的利用粗甘油發(fā)酵的最高水平。

1.4 地衣芽胞桿菌

在工業(yè)上，地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)應(yīng)用廣泛，主要用來生產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和抗生素等。雖然，研究者很早就發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌可以產(chǎn)生2，3-丁二醇，但是有關(guān)地衣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的文獻(xiàn)報(bào)道不多，產(chǎn)物濃度也很低。Nilegaonkar等［27］利用地衣芽胞桿菌，以葡萄糖為C源(20 g/L)，在37 ℃、pH 6.0 條件下，發(fā)酵 72 h，2，3-丁二醇質(zhì)量濃度為8.7 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的 94%，但生產(chǎn)強(qiáng)度僅有 0.12 g/(L·h)。Nilegaonkar等［28］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽胞桿菌能夠利用葡萄糖、果糖、纖維二糖、淀粉、蔗糖和甘露糖進(jìn)行2，3-丁二醇的生產(chǎn)，表明該菌具有較廣的底物譜。

Wang等［21］篩選得到一株能夠在高溫(50℃)條件下積累乳酸的菌株B.licheniformis BL1，經(jīng)過木糖馴化以及敲除乳酸脫氫酶基因(ldh)后得到的菌株B.licheniformis BL8能夠在50℃高溫條件下發(fā)酵葡萄糖和木糖生產(chǎn)高光學(xué)純度(98%)的(2R，3R)-丁二醇。在pH 5.0、5%通氣條件下，發(fā)酵30 g/L的葡萄糖和木糖分別獲得135 mmol(12.16 g/L)和153.3 mmol(13.82 g/L)2，3-丁二醇，轉(zhuǎn)化率分別為0.9 mol/mol葡萄糖和0.73 mol/mol木糖，最大生產(chǎn)速率分別為 29.4 和 26.1 mmol/(L·h)。Perego等［29］利用 B.licheniformis NCIMB 8095 發(fā)酵玉米淀粉水解液生產(chǎn)2，3-丁二醇，在最佳條件下，二醇(2，3-丁二醇與乙偶姻的總量)生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.58 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到 0.87 mol/mol，其中 2，3-丁二醇為6.44 g/L，乙偶姻為0.47 g/L。Li等［23］篩選得到了高溫高產(chǎn)2，3-丁二醇的地衣芽胞桿菌10-1-A，其可在50℃條件下高效發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)2，3-丁二醇，產(chǎn)量高達(dá) 115.7 g/L，同時(shí)生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到 2.4 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的94%，為目前高溫菌株產(chǎn)2，3-丁二醇的最高水平。該菌株的基因組已經(jīng)完成測序，對基因組的深入分析有望闡明其2，3-丁二醇高溫高效生產(chǎn)機(jī)制。

1.5 嗜熱地芽胞桿菌

目前，關(guān)于高溫條件下(50～60℃)產(chǎn)乳酸和乙醇的菌株研究較多，而在該條件下產(chǎn)2，3-丁二醇的菌株鮮見報(bào)道。Xiao等［22］首次報(bào)道了1株在高溫條件下產(chǎn)2，3-丁二醇和乙偶姻的嗜熱地芽胞桿菌，采油采出水經(jīng)100℃滅菌后涂布篩選平板，篩選得到了能夠產(chǎn)2，3-丁二醇和乙偶姻的菌株XT15，經(jīng)鑒定為Geobacillus。該菌株的最適生長溫度為45～55℃，其在pH 8.0時(shí)，產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)量最高，達(dá)到8.0 g/L。在優(yōu)化后的條件下培養(yǎng) 48 h，2，3-丁二醇和乙偶姻的產(chǎn)量分別為14.5和7.7 g/L。

2 芽胞桿菌發(fā)酵2，3-丁二醇的影響因素

微生物發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇受到很多因素的影響，其中溶氧(DO)和pH被認(rèn)為是影響最大的2個(gè)因素。此外，部分芽胞桿菌具有在高溫下生長并產(chǎn)生2，3-丁二醇的能力，且溫度對于2，3-丁二醇產(chǎn)量影響較大。因此，筆者總結(jié)了以下3個(gè)因素對芽胞桿菌2，3-丁二醇生產(chǎn)的影響。

2.1 溶氧

溶氧是影響微生物2，3-丁二醇發(fā)酵的關(guān)鍵因素，其水平高低影響到2，3-丁二醇的產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度以及副產(chǎn)物的形成［5］。一般來說，高的溶氧水平會(huì)導(dǎo)致生物量的提高，從而提高生產(chǎn)強(qiáng)度，但往往會(huì)造成2，3-丁二醇產(chǎn)量的降低;而低的溶氧會(huì)提高2，3-丁二醇的產(chǎn)量，但由于低溶氧條件下細(xì)胞密度的降低，會(huì)導(dǎo)致低的2，3-丁二醇生產(chǎn)強(qiáng)度。因此，為了提高2，3-丁二醇的生產(chǎn)效率，需要優(yōu)化一個(gè)適當(dāng)?shù)娜苎蹩刂撇呗浴?/p>

Yang等［14］研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)速能顯著影響B(tài).amyloliquefaciens B10-127 發(fā)酵 2，3-丁二醇產(chǎn)量。隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌體干質(zhì)量提高，發(fā)酵周期縮短，但是2，3-丁二醇產(chǎn)量有所降低，而副產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)量逐漸提高。

(2R，3R)-2，3-丁二醇是多粘芽胞桿菌發(fā)酵的主要產(chǎn)物，研究表明溶氧水平還影響多粘芽胞桿菌的光學(xué)純度。Nakashimada等［24］研究發(fā)現(xiàn)，溶氧水平影響多粘芽胞桿菌所產(chǎn)(2R，3R)-2，3-BD的e.e.值，其首先在搖瓶中驗(yàn)證了裝液量對產(chǎn)物e.e.值的影響，發(fā)現(xiàn)低裝液量條件下發(fā)酵產(chǎn)物主要為乙偶姻，(2R，3R)-2，3-BD 僅為 12.9 mmol/L。隨著裝液量的增加，2，3-丁二醇產(chǎn)量逐漸提高至97.4 mmol/L，e.e.值可達(dá)到 94%;而厭氧條件下，產(chǎn)量有所降低，僅為 74.4 mmol/L，但e.e.值則高達(dá) 99%。5 L發(fā)酵罐水平的實(shí)驗(yàn)也表明，多粘芽胞桿菌在厭氧條件下產(chǎn)生的(2R，3R)-2，3-BD光學(xué)純度大于98%［25］。H??ler等［17］在發(fā)酵罐上研究了不同攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)速率對多粘芽胞桿菌(2R，3R)-2，3-BD的產(chǎn)量和e.e.值的影響，結(jié)果表明隨著轉(zhuǎn)速的提高，2，3-丁二醇產(chǎn)量逐漸升高，而產(chǎn)物中(2R，3R)-2，3-BD所占比例不斷降低，通風(fēng)的作用小于轉(zhuǎn)速，這可能是由于高轉(zhuǎn)速條件下的表面產(chǎn)氣效應(yīng)提高了O2的溶解效率。該菌株在500 r/min、0.2 vvm(每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值)以及60 g/L酵母粉作為N源的條件下，補(bǔ)料分批發(fā)酵54 h，(2R，3R)-2，3-丁 二 醇 產(chǎn) 量 達(dá) 到 111.0 g/L，e.e.值 大于98%。

2.2 pH

pH是影響芽胞桿菌2，3-丁二醇產(chǎn)量及其不同異構(gòu)體的合成的重要因素。一般而言，堿性環(huán)境有利于有機(jī)酸的形成，從而降低2，3-丁二醇的產(chǎn)量;而在酸性環(huán)境中，有機(jī)酸的合成量顯著降低，醇類化合物的合成量顯著提高。不同菌株2，3-丁二醇生產(chǎn)的最適pH往往不同。

嗜熱地芽胞桿菌XT15在初始pH 8.0的條件下，2，3-丁二醇和乙偶姻的產(chǎn)量最高［22］。對于 B.amyloliquefaciens B10-127而言，初始 pH在5.5 ～7.5 之間時(shí)，2，3-丁二醇產(chǎn)量較高，其中 pH 6.5 時(shí)，2，3-丁二醇產(chǎn)量最高，達(dá)到 61.6 g/L［14］。Nilegaonkar等［27］研究發(fā)現(xiàn)地衣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn) 2，3-丁二醇的最適 pH是 6.0;而Wang等［21］利用敲除了 ldh基因的地衣芽胞桿菌BL5在50℃條件下發(fā)酵2，3-丁二醇時(shí)發(fā)現(xiàn):在pH 7.0時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物甲酸和乙醇;在 pH 5.0條件下，2，3-丁二醇為主要發(fā)酵產(chǎn)物，因 此，該 菌 的 最 適 pH 為 pH 5.0。Nakashimada等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在 pH 5.7 時(shí)，多粘芽胞桿菌所產(chǎn)生的meso-2，3-BD含量明顯提高，導(dǎo)致(2R，3R)-2，3-BD 的 e.e.值降低至94%;而 pH 在6.0 ～6.9 之間時(shí)，(2R，3R)-2，3-BD的e.e.值可達(dá)98%。菌株在pH 6.6時(shí)的產(chǎn)量降低較為顯著，僅為pH 6.0時(shí)產(chǎn)量的35%。以上結(jié)果表明:pH對于不同菌株2，3-丁二醇的生產(chǎn)有不同的影響，對于篩選到的新菌株，發(fā)酵pH的優(yōu)化尤為重要。

2.3 溫度

溫度也是影響2，3-丁二醇發(fā)酵生產(chǎn)的重要因素。對于 B.amyloliquefaciens B10-127來說，其 2，3-丁二醇的最適發(fā)酵溫度是37℃，而當(dāng)溫度低于37℃時(shí)，該菌株主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙偶姻，這一現(xiàn)象與菌株 Klebsiella oxytoca M1 相似［14，30］，推測其原因可能是菌株B10-127中的2，3-丁二醇脫氫酶的轉(zhuǎn)錄水平受到溫度的影響，導(dǎo)致其胞內(nèi)2，3-丁二醇脫氫酶活性在30℃時(shí)遠(yuǎn)低于37℃，從而積累乙偶姻。對多粘芽胞桿菌來說，溫度是影響其發(fā)酵木糖產(chǎn)2，3-丁二醇的顯著因素，當(dāng)溫度在30～39℃范圍內(nèi)，(2R，3R)-2，3-丁二醇產(chǎn)量隨著溫度的升高而升高［19］。而對菌株嗜熱地芽胞桿菌XT15來說，45～55 ℃是其最適生長溫度［22］。Nilegaonkar等［27］研究地衣芽胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇時(shí)發(fā)現(xiàn)其最適溫度是37℃;但筆者所在課題組Li等［23］利用篩選到的高溫菌株10-1-A進(jìn)行2，3-丁二醇生產(chǎn)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，與Nilegaonkar等報(bào)道的結(jié)果不同，地衣芽胞桿菌10-1-A的最適溫度是50℃。由此可知，溫度對于不同微生物有不同影響，即使是同一個(gè)種的不同菌株，也可能有不同的影響，因此有必要對新菌株進(jìn)行發(fā)酵溫度的優(yōu)化。

3 芽胞桿菌2，3-丁二醇合成途徑及調(diào)控機(jī)制

3.1 2，3-丁二醇合成途徑

微生物中2，3-丁二醇合成途徑是經(jīng)由混合酸途徑得到的，產(chǎn)物中除了2，3-丁二醇還有一系列副產(chǎn)物，主要有乙醇、乳酸、乙酸、甲酸和琥珀酸等副產(chǎn)物［2］。已有報(bào)道的2，3-丁二醇合成途徑主要包括3條(圖1)。其一為丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶作用下生成α-乙酰乳酸，并在α-乙酰乳酸脫羧酶作用下生成(3R)-乙偶姻，(3R)-乙偶姻在2，3-丁二醇脫氫酶的作用下還原得到2，3-丁二醇，這條途徑是微生物中2，3-丁二醇合成的主要途徑，其關(guān)鍵酶研究較多;其二為在有氧條件下，α-乙酰乳酸發(fā)生自發(fā)氧化脫羧生成雙乙酰，雙乙酰在2，3-丁二醇脫氫酶(或者叫做雙乙酰還原酶)的作用下，生成乙偶姻，再進(jìn)一步生成2，3-丁二醇，該途徑被認(rèn)為是2，3-丁二醇合成的支路途徑;其三為在葡萄糖消耗完的情況下，碳代謝阻遏(CCR)現(xiàn)象消失，此時(shí)雙乙酰在乙偶姻脫氫酶復(fù)合體(acetoin dehydrogenase enzyme system，AoDH ES)的作用下生成乙酰乙偶姻，并進(jìn)一步在乙酰乙偶姻還原酶(AACR)的作用下，生成乙酰丁二醇，乙酰丁二醇可進(jìn)一步生成2，3-丁二醇，但是催化此步反應(yīng)的酶不詳，且由于發(fā)酵過程中底物葡萄糖的存在會(huì)抑制該途徑，因此其在2，3-丁二醇發(fā)酵生產(chǎn)中的作用可以忽略［2，5，31-32］。

3.2 芽胞桿菌2，3-丁二醇合成基因簇及關(guān)鍵酶

在芽胞桿菌中2，3-丁二醇合成基因簇總結(jié)如圖2所示。由圖2可以看出:芽胞桿菌中的2，3-丁二醇合成基因簇結(jié)構(gòu)與革蘭氏陰性菌(如肺炎克雷伯氏菌)，有較大差異，主要表現(xiàn)為3個(gè)方面:①在芽胞桿菌中該基因簇的第2個(gè)基因是α-乙酰乳酸脫羧酶基因，第3個(gè)是α-乙酰乳酸合成酶基因，而肺炎克雷伯氏菌中α-乙酰乳酸合成酶基因在α-乙酰乳酸脫羧酶基因之前，這樣會(huì)影響2個(gè)酶的表達(dá)水平;②在芽胞桿菌中2，3-丁二醇脫氫酶獨(dú)立存在，而肺炎克雷伯氏菌中2，3-丁二醇脫氫酶基因bdh與alsR、alsD和alsS共同組成一個(gè)完整的基因簇;③絕大部分芽胞桿菌中的2，3-丁二醇脫氫酶為中鏈家族2，3-丁二醇脫氫酶(圖3)，其可同時(shí)催化(2R，3R)-2，3-BD 和 meso-2，3-BD 與(3R)-AC 和(3S)-AC間的可逆反應(yīng)［33-34］，而在肺炎克雷伯氏菌中的2，3-丁二醇脫氫酶屬于短鏈家族2，3-丁二醇脫氫酶(圖3)，該類酶主要催化 meso-2，3-BD與(3R)-AC間的可逆反應(yīng)［35］。目前，僅有在地衣芽胞桿菌中的2，3-丁二醇脫氫酶屬于短鏈家族2，3-丁二醇脫氫酶［23］。由于α-乙酰乳酸脫羧酶催化α-乙酰乳酸僅生成(3R)-AC，因此，2，3-丁二醇脫氫酶的不同導(dǎo)致了芽胞桿菌生成的2，3-丁二醇異構(gòu)體和肺炎克雷伯氏菌的不同。

圖1 芽胞桿菌中2，3-丁二醇合成途徑Fig.1 The 2，3-BD synthesis pathway in Bacillus sp.

3.3 芽胞桿菌2，3-丁二醇合成的調(diào)控

在微生物中2，3-丁二醇合成受到乙酸鹽、群體感應(yīng)等因素的調(diào)控，對于調(diào)控機(jī)制的深入研究有望開發(fā)基于基因調(diào)控的2，3-丁二醇高效生產(chǎn)策略。因此，2，3-丁二醇調(diào)控機(jī)制是目前生物法生產(chǎn)2，3-丁二醇研究的熱點(diǎn)之一。B.subtilis是目前唯一一種2，3-丁二醇合成基因簇調(diào)控機(jī)制得到研究的芽胞桿菌菌株。

圖2 產(chǎn)2，3-丁二醇芽胞桿菌中2，3-丁二醇合成基因簇Fig.2 Gene clusters for 2，3-BD biosynthesis in Bacillus sp.

圖3 2，3-丁二醇脫氫酶的進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of BDHs

Renna等［36］敲除了 B.subtilis中的 alsR 基因，發(fā)現(xiàn)alsSD操縱子不表達(dá)，而融合轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)也表明，AlsR蛋白對于alsSD操縱子的表達(dá)是必需的，且在穩(wěn)定期時(shí)表達(dá)量明顯提高。Fr?drich等［37］研究發(fā)現(xiàn)，alsSD操縱子對厭氧條件下的乙酸積累、乙酸的添加、低pH和好氧發(fā)酵的穩(wěn)定期等幾種條件的響應(yīng)均依賴于調(diào)控基因alsR的存在;利用B.subtilis的RNA polymerase進(jìn)行的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)證明，alsSD操縱子的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄需要調(diào)控蛋白AlsR的存在;對該啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，其包含一個(gè)高親和度結(jié)合位點(diǎn)——調(diào)控結(jié)合區(qū)(regulatory binding site)和一個(gè)低親和度結(jié)合位點(diǎn)——激活因子結(jié)合區(qū)(activator binding site)，兩者對該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄都是必需的，且AlsR蛋白與RBS和ABS結(jié)合后會(huì)形成穩(wěn)定的四聚體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的調(diào)控蛋白能夠起始alsSD操縱子的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。

由于在B.subtilis中的2，3-丁二醇脫氫酶基因bdhA與alsSD操縱子分布在基因組的不同位置，其是否受到調(diào)控蛋白AlsR的調(diào)控成為2，3-丁二醇合成調(diào)控的另一個(gè)問題。de Oliveira等［38］構(gòu)建了alsR基因敲除的菌株，并分別比較了野生菌株和突變菌株中bdhA-lacZ融合基因表達(dá)水平、穩(wěn)定期bdhA基因mRNA表達(dá)水平和2，3-丁二醇脫氫酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AlsR對bdhA基因表達(dá)的激活作用僅在穩(wěn)定期早期，敲除alsR基因后，bdhA基因的表達(dá)降低，但并未完全喪失。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)表明，AlsR并不能與bdhA基因的啟動(dòng)子相結(jié)合。以上結(jié)果表明，AlsR蛋白并不直接調(diào)控bdhA基因的表達(dá)，其可能通過其他蛋白間接調(diào)控bdhA基因的表達(dá)。

4 展望

4.1 高效生產(chǎn)2，3-丁二醇的嗜熱芽胞桿菌的篩選

目前，產(chǎn)2，3-丁二醇的菌株其生長溫度一般為30～40℃，在此溫度條件下容易染菌［22］。而在50～60℃條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)可以大大降低染菌的機(jī)會(huì)，同時(shí)該溫度條件有利于纖維素原料的同步糖化發(fā)酵，因此高溫條件下發(fā)酵生產(chǎn)乳酸、乙醇等產(chǎn)品的研究成為近年來研究的熱點(diǎn)。但是目前在可高效生產(chǎn)2，3-丁二醇的微生物中，肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌和黏質(zhì)沙雷氏菌均不能在此條件下生長，同時(shí)部分芽胞桿菌如枯草芽胞桿菌和多粘芽胞桿菌也不能在50～60℃條件下生長。因此，這些菌株不能夠用于高溫條件下生產(chǎn)2，3-丁二醇。但部分芽胞桿菌能夠在高溫條件下生長，如地衣芽胞桿菌、嗜熱地芽胞桿菌和凝結(jié)芽胞桿菌等，可以在50～60℃時(shí)生長并代謝葡萄糖、木糖等C源，生產(chǎn)2，3-丁二醇，但是其產(chǎn)量較克雷伯氏菌低。因此，篩選高效生產(chǎn)2，3-丁二醇的嗜熱芽胞桿菌將成為今后2，3-丁二醇發(fā)酵生產(chǎn)研究的熱點(diǎn)之一。

4.2 芽胞桿菌基因工程改造

芽胞桿菌的遺傳操作較為困難，目前在用于生產(chǎn)2，3-丁二醇的芽胞桿菌中，僅枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌BL1成功進(jìn)行了基因工程改造，尚未有關(guān)于解淀粉芽胞桿菌和多粘芽胞桿菌基因工程改造的研究報(bào)道。雖然以上菌株2，3-丁二醇產(chǎn)量較高，但其轉(zhuǎn)化率較低，對其副產(chǎn)物合成途徑進(jìn)行代謝工程改造，有望提高其轉(zhuǎn)化率，從而提高2，3-丁二醇生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。同時(shí)，凝結(jié)芽胞桿菌2-6、XZL9分別是高效利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)乳酸的高溫菌株，其基因組中有2，3-丁二醇合成基因簇，具有 2，3-丁二醇生產(chǎn)能力，對其進(jìn)行基因工程改造有望得到高效利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)2，3-丁二醇的高溫菌株，甚至可實(shí)現(xiàn)2，3-丁二醇的開放式發(fā)酵生產(chǎn)。

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