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牡荊苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響

2014-05-03 06:15周晨慧徐道華
中國(guó)藥業(yè) 2014年5期
關(guān)鍵詞:牡荊成脂骨量

周晨慧,張 雪,徐道華

(廣東醫(yī)學(xué)院,廣東 東莞 523808)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種易于擴(kuò)增、具有多種分化潛能的細(xì)胞,在體內(nèi)外特定的條件下,可分化為骨、軟骨、脂肪和肌腱等多種組織細(xì)胞。近年來發(fā)現(xiàn),MSCs與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),各種類型的骨質(zhì)疏松癥患者骨髓中的脂肪細(xì)胞與松質(zhì)骨的骨量成反比,骨量的減少與骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多總是相伴出現(xiàn)。MSCs向成脂細(xì)胞分化作用增強(qiáng)是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的原因之一[1-2]。因此,通過抑制MSCs向成脂方向分化已成為骨質(zhì)疏松癥防治的研究靶點(diǎn)之一。牡荊苷(vitexin)是自然界中最常見的黃酮碳苷,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖和神經(jīng)保護(hù)等作用[3-4]。通絡(luò)生骨膠囊對(duì)股骨頭壞死療效極好,對(duì)骨質(zhì)疏松癥也有較好的防治作用,牡荊苷為其主要成分[5]。研究表明,牡荊苷可抑制脂肪細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞株向脂肪細(xì)胞分化[6-7]。但牡荊苷是否對(duì)MSCs成脂分化具有抑制作用尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

牡荊苷(由本實(shí)驗(yàn)室自制,純度大于98%),制備方法見文獻(xiàn)[7];MTT及 DMSO、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛和地塞米松(均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(均購(gòu)自Gibco公司);所有引物由Invitrogen公司合成。

1.2 MSCs分離培養(yǎng)

1月齡SPF級(jí)SD大鼠,由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重(91.5 ± 5.7)g,動(dòng)物合格證編號(hào) SYXK(粵)2008-0007。飼料、飲水和墊料均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。采用全骨髓法分離,無菌條件下取出雙側(cè)股骨,除去肌肉,切除股骨兩端,沖出骨髓并懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置37℃及5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng),首次24 h換液,以后每3 d換液1次,細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí),0.25% 胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)分組

分為空白組及試驗(yàn)組??瞻捉M為MSCs達(dá)80%融合,開始加入分化誘導(dǎo)液,其組成為內(nèi)含0.5 mmol/L 3-異丁基 -1-甲基黃嘌呤、10 g/L 胰島素、0.2 mmol/L 吲哚美辛、1 μmol/L 地塞米松和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。試驗(yàn)組則為MSCs達(dá)80% 融合,開始加入分化誘導(dǎo)液及 10 μmol/L 或 50 μmol/L 的牡荊苷。

1.4 細(xì)胞生存率檢測(cè)

MSCs細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率。各組細(xì)胞培養(yǎng)3 d后,加入MTT使其最終質(zhì)量濃度為0.5 g/L,繼續(xù) 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 4 h,棄培養(yǎng)液,加入150 μL DMSO,振搖10 min,使甲瓚顆粒完全溶解,采用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.5 油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞成脂分化

細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)束后,用PBS沖洗細(xì)胞1次,10%甲醛室溫固定30 min,5 g/L的油紅異丙醇溶液用去離子水按3∶2稀釋后加入已固定好的細(xì)胞中,37℃孵育20 min,PBS清洗1次,倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR )和 CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 (C /EBP )mRNA 的表達(dá)[8]

收集各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,取1 μg總 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1 μg cDNA產(chǎn)物,加入熒光混合物和各基因上、下游引物(引物序列 PPARγ:5′-GAGCATGGTGCCTTCGCTGA-3′和5′-AGCAAGGCACTTCTGAAACCGA-3′;C /EBPα:5′-AAGGCCAAGAAGTCGGTGGA-3′和 5′-CAGTTCGCGGCTCAGCTGTT-3′; β -actin:5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′和 5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′,總體積 15 μL。PCR 擴(kuò)增條件為 95℃ 5 min,以后 95℃ 15 s,60℃ 60 s循環(huán) 40次。以 βactin作為內(nèi)參照,目的基因的表達(dá)用相對(duì)表達(dá)量表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞生存率的影響

牡荊苷濃度在 1~50 μmol/L范圍內(nèi)對(duì) MSCs生存率無顯著影響,表明在此濃度下牡荊苷對(duì)MSCs無顯著毒性,見表1。

表1 牡荊苷對(duì)MSCs生存率的影響

2.2 對(duì)MSCs成脂分化的影響

采用油紅O染色檢測(cè)牡荊苷對(duì)MSCs成脂分化的作用,結(jié)果表明,牡荊苷抑制MSCs成脂分化,且具有劑量依賴性,見圖1。

圖1 牡荊苷對(duì)MSCs成脂分化的影響

2.3 對(duì) PPAR 與 EBP mRNA表達(dá)的影響結(jié)果見表2。

表2 牡荊苷對(duì)PPAR 與EBP mRNA表達(dá)的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征,致使骨的脆性增加易于發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥及其所引起的骨折已成為嚴(yán)重危害人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。研究表明,骨組織中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能失衡是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要病因,目前臨床最常用的治療骨質(zhì)疏松癥藥物主要有雙磷酸鹽類等破骨細(xì)胞抑制藥,這些藥物雖然對(duì)骨質(zhì)疏松癥有一定療效,但存在不良反應(yīng)大、患者不能長(zhǎng)期耐受等缺點(diǎn)[9-10]。

近年來發(fā)現(xiàn),MSCs與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),MSCs成脂分化增強(qiáng)及成骨分化下降,是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要原因之一[1-2]。Dalle Carbonare等[2]的研究發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松癥患者外周血中的MSCs成骨分化能力顯著下降。Pino等[1]的研究也發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者M(jìn)SCs成脂分化作用增強(qiáng),成骨分化作用下降[1]。因此,通過抑制MSCs向成脂方向分化而促進(jìn)其向成骨方向分化將為骨質(zhì)疏松癥的防治提供新方向[11-13]。本試驗(yàn)首先觀察了牡荊苷對(duì)MSCs毒性的影響,結(jié)果顯示牡荊苷濃度在1~50 μmol/L范圍內(nèi)對(duì) MSCs細(xì)胞無顯著毒性。此外,本試驗(yàn)進(jìn)一步觀察了牡荊苷對(duì)MSCs成脂分化的作用,結(jié)果表明,牡荊苷可抑制MSCs成脂分化。

目前已鑒定出的對(duì)脂肪細(xì)胞分化有直接影響的轉(zhuǎn)錄因子主要有PPARγ和 C/EBPs[14]。C/EBPs主要有 3種同分異構(gòu)體,即C /EBPα、C /EBPβ 和 C /EBPδ。C /EBPβ 和 C /EBPδ 在 分 化癥的早期被誘導(dǎo)表達(dá),而C/EBPα是在分化的較晚期階段才表達(dá)。C/EBPα一旦表達(dá),隨即有大量的脂肪細(xì)胞分化的特異基因開始表達(dá),C/EBPα的過表達(dá)可加速3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化[15]。當(dāng) PPARγ 活化時(shí),MSCs向成脂方向分化[16]。PPARγ的過表達(dá)可促使成纖維細(xì)胞系向成脂轉(zhuǎn)化。PPARγ缺陷鼠的胚胎干細(xì)胞無成脂分化能力,同型PPARγ缺陷小鼠的骨量較野生型小鼠骨量增加[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),牡荊苷顯著抑制PPARγ和C/EBPα基因表達(dá),說明牡荊苷抑制MSCs成脂分化的機(jī)制可能與其抑制PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn):

[1]Pino AM,Rosen CJ,Rodriguez JP.In osteoporosis,differentiation of mesenchymal stem cells(MSCs)improves bone marrow adipogenesis[J].Biol Res,2012,45(3):279-287.

[2]Dalle Carbonare L,Valenti MT,Zanatta M,et al.Circulating mesenchymal stem cells with abnormal osteogenic differentiation in patients with osteoporosis[J].Arthritis Rheum,2009,60(11):3 356-3 365.

[3]Dong LY,Chen ZW,Guo Y,et al.Mechanisms of vitexin preconditioning effects on cultured neonatal rat cardiomyocytes with anoxia and reoxygenation[J].Am J Chin Med,2008,36(2):385-397.

[4]Lee CY,Chien YS,Chiu TH,et al.Apoptosis triggered by vitexin in U937 human leukemia cells via a mitochondrial signaling pathway[J].Oncol Rep,2012,28(5):1 883-1 888.

[5]劉少軍,陳小俊,馮麗敏,等.通絡(luò)生骨膠囊對(duì)大鼠應(yīng)力缺失性骨質(zhì)疏松的防治作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(6):170-173.

[6]Kim J, Lee I, Seo J, et al.Vitexin, orientin and other flavonoids from Spirodela polyrhiza inhibit adipogenesis in 3T3-L1 cells[J].Phytother Res,2010,24(10):1 543-1 548.

[7]閆 沖,林 勵(lì),劉紅菊,等.檀香葉黃酮類化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(22):3 130-3 133.

[8]Xu L,Song C,Ni M,et al.Cellular retinol-binding protein 1(CRBP-1)regulates osteogenenesis and adipogenesis of mesenchymal stem cells through inhibiting RXR -induced -catenin degradation[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(4):612-619.

[9]Sandhu SK,Hampson G.The pathogenesis,diagnosis,investigation and management of osteoporosis[J].J Clin Pathol,2011,64(12):1042-1050.

[10]尹 月,邱新野,高振梅,等.醫(yī)院抗骨質(zhì)疏松藥物用藥趨勢(shì)分析與合理應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中國(guó)藥業(yè),2012,21(7):26-29.

[11]Wagegg M,Gaber T,Lohanatha FL,et al.Hypoxia promotes osteogenesis but suppresses adipogenesis of human mesenchymal stromal cells in a hypoxia-inducible factor-1 dependent manner[J].PLoS One, 2012, 7(9):e46 483.

[12]Nuttall ME,Gimble JM.Controlling the balance between osteoblastogenesis and adipogenesis and the consequent therapeutic implications[J].Curr Opin Pharmacol,2004,4(3):290-294.

[13]Itakada I,Suzawa M,Kato S.Nuclear receptors as targets for drug development:crosstalk between peroxisome proliferator-activated receptor and cytokines in bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].J Pharmacol Sci,2005,97(2):184-189.

[14]Siersb?k R,Nielsen R,Mandrup S.Transcriptional networks and chromatin remodeling adipogenesis[J].Trends Endocrinol Metab,2012,23(2):56-64.

[15]Rusty D,Park BH,Davis KE,et al.Activation of MEK /ERK signaling promotes adipogenesis by enhancing peroxisome proliferator 2 activated receptor gamma(PPAR )and C/EBP gene expression during the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes[J].J Biol Chem,2002,277(48):46 226-46 232.

[16]Cristancho AG,Lazar MA.Forming functional fat:a growing understanding of adipocyte differentiation[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2011, 12(11):722-734.

[17]Akune T,Ohba S,kamekura S,et al.PPAR insufficiency enhances osteogenesis through osteoblast formation from bone marrow progenitors[J].J Clin Invest,2004,113(6):846-855.

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