杜冠尚，羅 磊，張向輝，夏迎利，段雪瑩

（河南科技大學(xué)，河南洛陽(yáng) 471000）

0 引言

綠豆（Mung Bean，簡(jiǎn)稱M.），別名青小豆，蝶花亞科豇豆屬，在中國(guó)已有2 000多年栽培史[1]，年產(chǎn)量約70萬(wàn)t。綠豆皮是綠豆深加工過(guò)程中由于去皮或去渣產(chǎn)生的廢棄物，約占綠豆質(zhì)量的8%左右[2]。這些綠豆皮或加工為廉價(jià)飼料或被丟棄，未得到有效利用，造成大量資源浪費(fèi)。研究表明，綠豆皮含豐富的黃酮、膳食纖維、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，抗氧化抑菌消炎功能遠(yuǎn)高于綠豆[3-5]。

牡荊素（Vitexin），碳苷黃酮活性單體[6-7]，其顯著的抑菌能力[8-9]、抗氧化活性[10-12]和神經(jīng)保護(hù)作用[13]引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。牡荊素的提取大多從檀香葉、山楂葉、金銀花中提取[14-17]，這些原料本身牡荊素含量少，且提取成本高。而綠豆皮產(chǎn)量豐富，主要抗氧化成分為牡荊素，含量超過(guò)綠豆皮黃酮的50%[18-19]，可作良好的牡荊素提取替代原料。目前，關(guān)于綠豆皮黃酮[20]、膳食纖維[21-23]、葉綠素[24]的報(bào)道較多，缺乏綠豆皮牡荊素深入研究。

牡荊素溶于有機(jī)溶劑，但綠豆皮質(zhì)地堅(jiān)硬，單純利用有機(jī)溶劑提取較難。超聲提取操作簡(jiǎn)便、效率高，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于功能性成分的提取[25-27]。超聲波引起的機(jī)械振動(dòng)加速反應(yīng)進(jìn)程，綠豆皮細(xì)胞壁在碰撞摩擦中軟化，促進(jìn)有效成分溶出。因此，采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取綠豆皮牡荊素，進(jìn)一步研究其抗氧化活性，為牡荊素提取提供新來(lái)源，實(shí)現(xiàn)綠豆皮廢物利用，為綠豆皮資源綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆皮（干燥過(guò)篩備用），實(shí)驗(yàn)室自制；牡荊素標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），上海源葉生物科技有限公司提供；鐵氰化鉀，洛陽(yáng)市創(chuàng)偉化玻有限公司提供；三氯乙酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；水楊酸，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供；鄰苯三酚，上海永葉生物科技有限公司提供；三羥甲基甲烷（Tris Base），上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司提供。

Eclassical3100型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品；FA1006型分析天平，上?？茖W(xué)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；KQ-500DE型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；SNWTZ-5N型冷凍干燥箱，北京新芝生物儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S6A型水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；FZ102型粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；Eclassical3100型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司產(chǎn)品；HL-2B型數(shù)顯恒流泵，上海馳唐電子有限公司產(chǎn)品；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科委永興儀器有限公司產(chǎn)品；TDZ5-WS型和H1750型式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，1.7 μm）；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)278 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min；流動(dòng)相：A為水（0.5%甲酸），B為乙腈（色譜級(jí)）；梯度洗脫條件：0～3 min，5%B；3～6 min，10%B；6～9 min，15%B；9～12 min，20%B；12～15 min，25%B；15～20 min，30%B；20～25 min，20%B；25～30 min，10%B；30～35 min，5%B。

1.2.2 綠豆皮牡荊素提取及測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定量綠豆皮粉于100 mL具塞三角瓶，按比例加入70%乙醇，超聲處理提取，以轉(zhuǎn)速4 800 r/min離心20 min，將上清液旋蒸濃縮后加4倍體積無(wú)水乙醇靜置，再次以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心30 min，過(guò)膜（0.22 μm），于波長(zhǎng)278 nm處測(cè)定峰值，代入牡荊素標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=41.997X+16.217，R2=0.999 5），計(jì)算提取量。

式中：Y——峰面積；

V——濃縮后體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，mg；

5——稀釋倍數(shù)。

1.2.3 綠豆皮牡荊素提取工藝研究

以牡荊素提取量為指標(biāo)，考查料液比（1∶3，1∶5，1∶7，1∶9，1∶11，1∶13）、超聲溫度（35，40，45，50，55，60 ℃）、超聲時(shí)間 （10，20，30，40，50，60 min）、超聲功率 （200，250，300，350，400，450 W）對(duì)提取量的影響。響應(yīng)面優(yōu)化超聲條件，將各因素設(shè)為3個(gè)水平。

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.4 綠豆皮牡荊素體外抗氧化活性研究

提取液旋蒸濃縮至有淡黃色晶體析出，真空冷凍干燥成粉（即綠豆皮牡荊素）備用?？傔€原能力測(cè)定及計(jì)算參照文獻(xiàn)[28]，DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定分別參照文獻(xiàn)[29]、文獻(xiàn)[30]、文獻(xiàn)[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲提取結(jié)果

2.1.1 超聲提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲條件對(duì)牡荊素提取量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 超聲條件對(duì)牡荊素提取量的影響

由圖1可知，綠豆皮牡荊素提取量隨料液比增大而增加，比例1∶9時(shí)，提取量為1.903 mg/g，繼續(xù)加大溶液比例提取量增加緩慢。溶劑多，物質(zhì)間傳質(zhì)動(dòng)力大，牡荊素易溶出，溶劑過(guò)多會(huì)延長(zhǎng)濃縮時(shí)間，因此1∶9為最佳料液比。牡荊素提取量隨超聲溫度升高，增速先快后慢并有下降趨勢(shì)，提取溫度為50，55℃時(shí)提取量分別為1.916，1.926 mg/g，本著節(jié)能高效原則選擇50℃為最佳溫度。牡荊素提取量隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)先增加后下降，40 min時(shí)有最大提取量1.936 mg/g。細(xì)胞內(nèi)外存在濃度梯度差，短時(shí)超聲為牡荊素溶出提供動(dòng)力；長(zhǎng)時(shí)超聲產(chǎn)生的熱能和空化效應(yīng)會(huì)破壞牡荊素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此最佳超聲時(shí)間為40 min。隨超聲功率的增加，提取量先增加后下降。超聲功率為350 W時(shí)綠豆皮牡荊素提取量最大為1.936 mg/g。功率越大，溶劑體系的機(jī)械振動(dòng)越強(qiáng)，牡荊素溶出越快；功率過(guò)大空化泡大量積聚，阻礙超聲波在料液之間的傳遞，因此350 W為最佳超聲功率。

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化超聲提取結(jié)果

用Design Expert 8.0.5.0軟件中Box Behnken進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。將數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，方程為：

超聲波提取綠豆皮牡荊素響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，超聲波提取綠豆牡荊素響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表3。

表2 超聲波提取綠豆皮牡荊素響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 超聲波提取綠豆牡荊素響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由表3可知，CD交互作用極顯著（p＜0.01）、BD交互作用較顯著 （p＜0.05）、模型極顯著（p＜0.01）、失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），模型設(shè)計(jì)合理。模型決定系數(shù)R2=0.986 7，說(shuō)明模型能解釋98.67%響應(yīng)值變化，擬合程度較好；因變量與自變量之間復(fù)相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.973 4，說(shuō)明該模型能較好地反映綠豆皮牡荊素提取量與各因素之間的關(guān)系。F值越大，表明該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)越重要，各因素對(duì)牡荊素提取量的影響順序?yàn)镈＞C＞B＞A。

2.1.3 響應(yīng)面交互作用分析

二次模型所做出的響應(yīng)面可以評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素對(duì)綠豆皮牡荊素提取量的交互作用，并由此確定最佳水平范圍。響應(yīng)值越大，各參數(shù)等高線呈橢圓形，兩因素交互作用越顯著。

各因素交互作用對(duì)綠豆皮牡荊素提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖見(jiàn)圖2。

由圖2可知，超聲時(shí)間和超聲功率、超聲溫度和超聲功率間等高線圖均為橢圓，對(duì)結(jié)果影響極顯著（p＜0.01），前者交互作用較后者顯著，與表3方差分析回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

理論最優(yōu)組合為料液比1∶8.88，超聲溫度49.36℃，超聲時(shí)間45.71 min，超聲功率339.86 W，提取量為1.958 mg/g。為便于操作，將最優(yōu)組合調(diào)整為料液比1∶9，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間46 min，超聲功率350 W，驗(yàn)證最優(yōu)組合得平均提取量為1.966 mg/g，優(yōu)化模型合理。

牡荊素標(biāo)品（左） 及粗提液（右） HPLC圖見(jiàn)圖3。

圖2 各因素交互作用對(duì)綠豆皮牡荊素提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖

由圖3可知，牡荊素粗提液與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間分別為14.728 min和14.739 min，說(shuō)明提取成分為牡荊素。

2.2 綠豆皮牡荊素體外抗氧化活性分析

2.2.1 綠豆皮牡荊素總還原能力測(cè)定結(jié)果

圖3 牡荊素標(biāo)品及粗提液HPLC圖

總還原力測(cè)定是利用鐵離子在酸性條件下化合價(jià)變化所引起的顏色變化來(lái)判斷的，顏色越深，吸光值越大，還原能力越強(qiáng)。

綠豆皮牡荊素總還原能力見(jiàn)圖4。

圖4 綠豆皮牡荊素總還原能力

由圖4可知，在0.03～0.18 mg/mL內(nèi)，隨質(zhì)量濃度增加，綠豆皮牡荊素總還原力呈上升趨勢(shì)。質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL時(shí)，綠豆皮牡荊素吸光值為0.813，達(dá)到維C吸光值1.329半數(shù)以上。

2.2.2 綠豆皮牡荊素DPPH自由基清除結(jié)果

DPPH·結(jié)構(gòu)中含有的孤對(duì)電子與自由基清除劑結(jié)合，顏色由深紫色變成淡黃色，褪色程度與DPPH自由基有定量關(guān)系。

綠豆皮牡荊素DPPH自由基清除能力見(jiàn)圖5。

由圖5可知，在質(zhì)量濃度0.03～0.18 mg/mL內(nèi)，綠豆皮牡荊素清除自由基能力呈上升趨勢(shì)，質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL時(shí)，清除率為70.49%，接近同濃度下維C清除率92.34%。兩者DPPH自由基清除的IC50分別為0.119，0.036 mg/mL。

圖5 綠豆皮牡荊素DPPH自由基清除能力

2.2.3 綠豆皮牡荊素羥基自由基清除結(jié)果

H2O2+Fe2+=·OH+H2O+Fe3+反應(yīng)生成的·OH 與水楊酸結(jié)合生成的2,3-二羥基苯甲酸于波長(zhǎng)510 nm處有特殊吸收，加入抗氧化劑與水楊酸爭(zhēng)奪羥基自由基，從而減少顯色物質(zhì)生成。

綠豆皮牡荊素羥基自由基清除能力見(jiàn)圖6。

圖6 綠豆皮牡荊素羥基自由基清除能力

由圖6可知，綠豆皮牡荊素質(zhì)量濃度在0.03～0.18 mg/mL時(shí)，自由基清除率與其濃度呈明顯正相關(guān)，質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL時(shí)，清除率61.36%，相當(dāng)于0.09 mg/mL下維C的清除率。兩者·OH清除的IC50分別為0.132，0.069 mg/mL。

2.2.4 綠豆皮牡荊素超氧陰離子清除結(jié)果

鄰苯三酚在弱堿性條件下自氧化生成超氧陰離子自由基和于波長(zhǎng)325 nm處有特征吸收峰的中間產(chǎn)物，抗氧化劑加入后迅速與O2-·反應(yīng)阻止中間產(chǎn)物聚集，因此吸光度值的大小可以間接反映物質(zhì)的抗氧化能力。

綠豆皮牡荊素超氧陰離子清除能力見(jiàn)圖7。

由圖7可知，質(zhì)量濃度在0.03～0.12 mg/mL時(shí)，綠豆皮牡荊素超氧陰離子清除率上升迅速，質(zhì)量濃度大于0.12 mg/mL時(shí)清除率上升緩慢，質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到63.28%。綠豆皮牡荊素和維C清除O2-·的IC50分別為0.127，0.034 mg/mL。

3 結(jié)論

圖7 綠豆皮牡荊素超氧陰離子清除能力

采用超聲波醇法提取綠豆皮牡荊素，用響應(yīng)面法建模分析。結(jié)果表明，在提取液為70%乙醇條件下，料液比1∶9，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間46 min，超聲功率350 W，有最大提取量1.966 mg/g，試驗(yàn)誤差小，模型擬合較好。4種抗氧化試驗(yàn)均表明綠豆皮牡荊素有較好的抗氧化能力，對(duì)不同的自由基，有不同的清除能力。粗提液中牡荊素HPLC色譜圖雖然與牡荊素標(biāo)品保留時(shí)間一致，但仍有雜峰干擾，后期將對(duì)粗提液進(jìn)行純化處理，提高純度。