周星彤，裴 琳，盧京光

(青島市藥品檢驗(yàn)所，山東 青島 266071)

慶大霉素普魯卡因維B12顆粒(Gentamicin Sulfate，Procaine Hydrochloride and Vitamin B12Granules)為復(fù)方制劑，其組分為每袋含硫酸慶大霉素20 mg;鹽酸普魯卡因0.1 g;維生素 B12(Vitamin B12，VB12)0.02 mg。所用輔料包括甘露醇、阿司帕坦、食用蘋果香精、羧甲基纖維素鈉和檸檬黃。其中VB12的含量極低，難于準(zhǔn)確定量。目前，國(guó)內(nèi)尚無檢測(cè)慶大霉素普魯卡因維生素B12顆粒中微量VB12的含量測(cè)定方法，國(guó)外藥典也未見收藏。國(guó)內(nèi)用于檢測(cè)VB12的方法多采用微生物法［1］;不少文獻(xiàn)報(bào)道使用HPLC 法測(cè)定微量的 VB12［2，3］，多由于靈敏度不夠等原因，無法準(zhǔn)確檢測(cè)藥品中的微量VB12;此外，近些年國(guó)內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道使用電化學(xué)方法測(cè)定B12的含量［4～6］，但方法復(fù)雜，繁瑣。

快速分離液相色譜(Rapid resolution liquid chromatography，RRLC)是近年來迅速發(fā)展的液相色譜新技術(shù)，其原理是通過增加液相系統(tǒng)耐高壓性能，降低色譜柱固定相粒徑、色譜柱內(nèi)徑及長(zhǎng)度，從而提高色譜柱柱效，實(shí)現(xiàn)縮短分析時(shí)間，提高分離度和靈敏度的目的。本文建立了RRLC法用于測(cè)定慶大霉素普魯卡因維生素B12顆粒中微量VB12的含量，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，靈敏度高。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200快速分離液相色譜儀(配G1312B二元泵，G1314 VWD檢測(cè)器，G1316B柱溫箱，G1322A脫氣機(jī)，500 μL擴(kuò)展進(jìn)樣環(huán)及Chemstation色譜工作站)。

1.2 試藥 VB12對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào):10248－200802，HPLC含量95.5%);慶大霉素普魯卡因維生素B12顆粒(河北華威德菲爾藥業(yè)有限公司，每包含VB1220 μg，批號(hào):070505、080520、090306);磷酸二氫鉀為分析純;甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱:Agilent SB－ C18柱(3.0 mm ×150 mm，1.8 μm);流動(dòng)相:0.005 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液(每1000 mL加磷酸0.5 mL)－ 甲醇(75∶25)，流速:0.5 mL·min－1。檢測(cè)波長(zhǎng):361 nm，柱溫:40 ℃，進(jìn)樣量:200 μL。

系統(tǒng)適用性:取空白溶液、線性關(guān)系考察項(xiàng)下濃度為200 ng· mL－1的對(duì)照品溶液及樣品測(cè)定項(xiàng)下的供試品溶液同時(shí)按上述色譜條件進(jìn)行分析，色譜圖見圖1?？梢钥闯?，供試品溶液色譜圖中VB12峰與相鄰峰的分離度良好，符合中國(guó)藥典要求，樣品中其他組分不干擾VB12的測(cè)定。

2.2 溶液配制 對(duì)照儲(chǔ)備液:精密稱取VB12對(duì)照品20 mg至200 mL 量瓶中，加0.005 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液溶解并制成0.10 mg· mL－1的溶液作為儲(chǔ)備液，該溶液可在4℃放置30 d。

樣品溶液:精密稱取供試品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于VB1220 μg)，置100 mL 量瓶中，加0.005 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液超聲溶解并加至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

空白溶液:按照慶大霉素普魯卡因維生素B12顆粒的處方比例制備不含VB12的空白樣品，并按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法處理，作為空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察:精密量取儲(chǔ)備液適量，用0.005 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液分別稀釋成 10、25、50、100、200、400、800、1000、1200、1400 ng· mL－1的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件分析。以峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為:Y=0.481011X－1.6689，r=0.9998(n=9)，說明 VB12在10～1400 ng·mL－1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 RRLC色譜圖

精密度試驗(yàn):取線性關(guān)系考察項(xiàng)下濃度為200 ng· mL－1的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得VB12峰面積的RSD為0.51%，表明本方法具有良好的精密度。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品，按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，測(cè)得VB12含量平均值為99.4%，RSD為0.34%(n=6)。表明本方法重復(fù)性較好。

最低檢出限的測(cè)定:取線性關(guān)系考察項(xiàng)下濃度為10 ng· mL－1的對(duì)照品溶液作為檢出限檢測(cè)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，以3倍信噪比計(jì)算方法的最低檢出限為8.0 ng· mL－1。

加樣回收試驗(yàn):選取批號(hào)為080520的樣品進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)，樣品中 VB12的含量為7.92 μg·g－1。按表1方式進(jìn)行取樣并定量加入2.5 μg·mL－1對(duì)照品溶液，按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法制成三個(gè)濃度的回收率測(cè)定溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4 樣品測(cè)定與結(jié)果 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，所得峰面積代入回歸方程進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果見表2。結(jié)果表明，本品3批含量均在標(biāo)示量要求范圍內(nèi)(不低于90.0%)，批間差異較小。

表2 慶大霉素普魯卡因維生素B12顆粒中VB12含量測(cè)定結(jié)果(標(biāo)示量%)

3 討論

本文采用RRLC法測(cè)定微量VB12，通過高壓液相系統(tǒng)及固定相粒徑為1.8 μm的快速分離色譜柱將樣品各組分進(jìn)行良好分離。但保留時(shí)間略長(zhǎng);樣品前處理也較繁瑣，需去除顆粒劑中的糖。日后改進(jìn)實(shí)驗(yàn)中可考慮在分離柱之前加入預(yù)柱，通過柱切換功能在線分離掉樣品中的糖分，達(dá)到保護(hù)色譜柱，提高分離效果的目的。

［1］盧京光，裴琳，楊龍華.在線微生物濁度法測(cè)定多維元素片中微量維生素B12的含量［J］.藥物分析，2011，31(9):1837－1839.

［2］吳楠，姜金斗，陶大利，等.免疫親和柱凈化/高效液相色譜法測(cè)定乳粉中維生素 B12的含量［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32(3):389 －392.

［3］儲(chǔ)小軍，陶保華，賴世云，等.固相萃取－二維液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方食品中的維生素B12［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，39(22):185 －190.

［4］陳靜，金葉玲.維生素B12在碳納米管修飾玻碳電極上的電化學(xué)行為［J］.淮陰工學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，19(5):73－78.

［5］劉景，王軍，全先高，等.VB12在多壁碳納米管修飾電極上的電化學(xué)行為與含量測(cè)定［J］.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，36(3):171 －173.

［6］李秀珍，劉風(fēng)琴，呂光宇，等.紫外分光光度法測(cè)定維生素B12注射液含量的不確定度分析［J］.齊魯藥事，2012，31(2):90－91.