趙娟等

【摘要】目的：探究PAX6在酒精處理幼鼠中對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響。方法：妊娠5d小鼠隨機(jī)分為2組，在仔鼠出生后7天時(shí)建模，實(shí)驗(yàn)組用20%的酒精溶液，按每只2.5克/千克分兩次皮下注射，兩次間隔兩小時(shí)；對(duì)照組用生理鹽水代替酒精做同樣的處理。24h后，取腦組織切片進(jìn)行HE和PAX6免疫組化染色。結(jié)果：HE染色結(jié)果說明皮質(zhì)和丘腦下部均有一定量神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，免疫組化顯示實(shí)驗(yàn)組中PAX6的在皮質(zhì)和丘腦下部的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高。結(jié)論：酒精對(duì)仔鼠神經(jīng)細(xì)胞的損傷可能與PAX6轉(zhuǎn)錄因子過量表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】酒精；PAX6；轉(zhuǎn)錄因子；神經(jīng)細(xì)胞；凋亡

【中圖分類號(hào)】R245 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1004-4949（2014）01-0269-01

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科技項(xiàng)目（12C0510）

酒精作為常見的致畸原，與人類的生長(zhǎng)發(fā)育緊密相關(guān)。能夠使中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變、以及精神行為異常等[1]。目前認(rèn)為酒精是導(dǎo)致兒童智力障礙的可預(yù)防的非遺傳性因素。酒精對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有直接或間接的毒害作用，可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的大量凋亡[2]，尤其是在快速發(fā)育期或突觸形成期，即使接觸一次酒精也能造成小鼠大腦皮質(zhì)和小腦神經(jīng)元的凋亡[3]。

PAX6基因編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，在脊椎動(dòng)物中不僅對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)有重要的作用[4]，還對(duì)腦的發(fā)育和結(jié)構(gòu)完整性有一定影響[5]。PAX6的作用在正常和異常的細(xì)胞增生中均有影響，廣泛覆蓋細(xì)胞的增生、移行、黏附和信號(hào)傳導(dǎo)等各個(gè)途徑[6]。本文就酒精處理仔鼠中PAX6的表達(dá)情況作一研究，為臨床上酒精對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的治療和研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

（1） 動(dòng)物與藥品、器材：湖南農(nóng)大動(dòng)物中心提供的成年昆明小鼠，體重20-30g；56°紅星二鍋頭，由北京紅星股份有限公司提供；PAX6抗體購(gòu)自英國(guó)abcam公司，冰凍切片機(jī)是德國(guó)slee公司MEV型號(hào)；顯微鏡是日本OLYMPUS公司BX51T-32P01型。

（2） 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組：雌、雄鼠合籠，每日8時(shí)檢查雌鼠是否有陰道栓確定

受孕日期，定為妊娠開始，妊娠5d小鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組和試驗(yàn)組。幼鼠出生第1天稱為P0（P=days postnatal，P0=the first 24hours afterbirth），在仔鼠P7齡時(shí)，按Ikonomidou C的方法建模[7]，試驗(yàn)組用20%的酒精溶液，每只按2.5克/千克分兩次皮下注射，兩次間隔兩小時(shí)；對(duì)照組用生理鹽水代替酒精做同樣的處理，24小時(shí)后，取材對(duì)大腦進(jìn)行組織檢查。

（3） 取2組幼鼠，2.5%三溴乙醇（16mL/kg）腹腔注射麻醉，用生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心灌流。取出大腦組織，4%甲醛固定過夜，30%蔗糖脫水至組織沉底。PBS（0.1 mol/L，pH7.4）液沖洗干凈后，用包埋膠-30℃包埋，制成切片標(biāo)本。冰凍切片機(jī)切片，厚度為20μm。

（4） HE染色：蘇木素染色，自來水洗，分化，自來水浸泡，伊紅染色，常規(guī)脫水、透明、封片。

（5） 免疫組化：一抗是rabbit anti-PAX6 receptor，切片置于4 ℃含一抗的體積分?jǐn)?shù)為5%血清和0.3%Triton-100的PBS溶液中反應(yīng)過夜，次日經(jīng)PBS浸洗后，切片在相應(yīng)的二抗里孵育2 h，HRP標(biāo)記鏈霉菌抗生素蛋白三抗1h，DAB顯色，然后在顯微鏡下觀察檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1 酒精對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響

對(duì)照組中神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則并可見突觸，而在實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞在組織中成單個(gè)散在分布，呈圓形，細(xì)胞核聚集成團(tuán)塊狀深染，胞質(zhì)濃縮紅染，說明在實(shí)驗(yàn)組酒精處理后神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。（圖1）

3討論

酒精是一種親神經(jīng)物質(zhì)，對(duì)人體許多系統(tǒng)器官均有損傷作用，其中神經(jīng)系統(tǒng)是其損傷的重要靶器官之一。研究顯示酒精暴露可導(dǎo)致兒童腦發(fā)育障礙進(jìn)而引起學(xué)習(xí)、記憶、智力水平下降和精神行為功能缺陷，即使停止濫用，已造成的損害仍將繼續(xù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了PAX6轉(zhuǎn)錄因子在幼鼠皮質(zhì)和丘腦下部中的表達(dá)，進(jìn)一步的免疫組化分析顯示，主要在兩個(gè)區(qū)域內(nèi)表達(dá)上調(diào)。這些實(shí)驗(yàn)初步論證了幼鼠皮下注射酒精后以后，PAX6轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)與神經(jīng)細(xì)胞死亡的關(guān)系。對(duì)于臨床上酒精致神經(jīng)細(xì)胞損傷治療來說，PAX6有望作為一個(gè)基因診斷和基因治療的靶點(diǎn)[9]。

綜上所述，在酒精導(dǎo)致神經(jīng)元損傷過程中PAX6的過量表達(dá)可能是重要機(jī)制之一?，F(xiàn)今認(rèn)為的機(jī)制可能有：自由基損傷，視黃醛缺少，基因表達(dá)水平改變，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)變化和生長(zhǎng)因子活性改變五大類。酒精可能通過這些不同的機(jī)制協(xié)同起作用，使中樞神經(jīng)發(fā)生一系列生化反應(yīng)，造成分子、細(xì)胞等各水平變化，最終導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

參考文獻(xiàn)

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