李平 費(fèi)小雯 李興涵 鄧曉東

摘 要 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺氮、缺硫的環(huán)境有利于萊茵衣藻油脂的積累，說明與氮、硫同化相關(guān)的基因也與油脂合成有著密切的關(guān)系。分析了氮、硫同化通路相關(guān)基因，選擇氮同化相關(guān)的6個(gè)基因（NAR3、NAR1.1、NII1、NIA1、NIT2、AOX1）以及硫同化相關(guān)的6個(gè)基因（SULP1、SIR1、SLT1、ARS1、SULTR1、ATS1）進(jìn)行qRT-PCR分析。對(duì)萊茵衣藻CC124以及CC425藻株分別進(jìn)行缺氮、缺硫處理，Trizol法連續(xù)提取4 d的RNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這12種基因均較對(duì)照上調(diào)表達(dá)，其中，萊茵衣藻氮、硫運(yùn)載體基因上調(diào)表達(dá)非常顯著。缺氮條件下NAR3、NAR1.1較正常最高上調(diào)表達(dá)200倍；缺硫條件下SLT1較對(duì)照有1 000～2 000倍的mRNA表達(dá)量，SULTR2也最高能增高450倍的表達(dá)量。

關(guān)鍵詞 萊茵衣藻；缺氮；缺硫；qRT-PCR

中圖分類號(hào) Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，各國(guó)對(duì)能源的需求日益增大，而傳統(tǒng)的化石能源日益枯竭，因此開發(fā)新的可再生能源成為當(dāng)今世界各國(guó)關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。同時(shí)，Zeller等[2]還研究了發(fā)展中國(guó)家生物燃料產(chǎn)業(yè)的前景和挑戰(zhàn)，及其糧食安全及全球糧食價(jià)格升高帶來的威脅。生物柴油作為一種新興的可再生生物能源，清潔環(huán)保，易生物降解，燃燒后排放的氮氧化物和CO2少，且可直接用于現(xiàn)有的柴油發(fā)動(dòng)機(jī)，是良好的化石燃料替代物[3]。其中，微藻是制取生物柴油最有希望和前途的原料，具有分布廣泛、環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速、油脂含量高等特點(diǎn)[4]。因此，對(duì)微藻進(jìn)行深入的研究具有非常可觀的應(yīng)用前景。

微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛，營(yíng)養(yǎng)豐富、光合利用度高的自養(yǎng)低等水生植物。在適宜條件下，微藻通常處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量較低，且多為極性脂（polar lipid），如磷脂（phosphor lipid）。而在脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)很快積累大量中性脂（neutral lipid），如甘油三脂（triacylglycerol， TAG）[5]。其中，氮素是組成氨基酸的必要成分之一，氮素的缺乏直接限制光合膜蛋白以及包括葉綠素在內(nèi)的其他色素分子的合成，最終影響光合放氧能力[6]，當(dāng)植物缺硫時(shí)降解植物組織中的硫庫(kù)，釋放硫元素，表現(xiàn)為總蛋白和葉綠素含量降低[7]。李亞軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)氮元素缺乏可誘導(dǎo)萊茵衣藻（Chlamydmonas reinhardtii）在細(xì)胞內(nèi)大量積累三酰甘油。硫營(yíng)養(yǎng)限制也能使微藻細(xì)胞的含油量大幅提高[9]。本研究分析氮、硫同化通路中的相關(guān)基因，意圖從這些基因中找到具有重要研究?jī)r(jià)值的基因。

本實(shí)驗(yàn)室著重研究萊茵衣藻在能源方面的應(yīng)用價(jià)值，研究發(fā)現(xiàn)，在缺氮、缺硫的條件下有利于油脂的積累，能夠在氮、硫同化中找到與油脂合成密切相關(guān)的基因，本次實(shí)驗(yàn)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行初步的摸索，對(duì)以后的研究有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

藻株： Chlamydomonas reinhardtii CC124和細(xì)胞壁缺陷型的Chlamydomonas reinhardtii CC425（購(gòu)于美國(guó)杜克大學(xué)衣藻中心）。

主要試劑及儀器：酶標(biāo)儀（BIO-TEKELx800）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）購(gòu)于TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（STRATAGENE Mx3005）。

1.2 方法

1.2.1 萊茵衣藻的培養(yǎng)及相關(guān)生理生化指標(biāo)的測(cè)定

（1）藻株生長(zhǎng)曲線繪制及生物量測(cè)定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)藻在490 nm波長(zhǎng)下有特定的吸收值[10]，用酶標(biāo)儀（BIO-TEKELx800）分別測(cè)定8瓶不同時(shí)長(zhǎng)500 mL培養(yǎng)的CC425藻株在490 nm下的吸光值，并對(duì)應(yīng)稱取干重，根據(jù)吸光值與干重對(duì)應(yīng)的關(guān)系，繪制CC425藻株干重標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到本研究萊茵衣藻的生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.599 4x-0.016 3[11]。

將CC124、CC425藻株分別接種于含有50 mL HSM培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，置于在25 ℃，全光照，光照強(qiáng)度3 000～4 500 lx的培養(yǎng)條件下220 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將藻液進(jìn)行離心、富集，用少量HSM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋、打勻，將CC124接入50 mL HSM、HSM-N培養(yǎng)基，CC425接入50 mL HSM和HSM-S的培養(yǎng)基中，HSM和HSM氮、硫元素缺乏培養(yǎng)基參照費(fèi)小雯等[9]培養(yǎng)基的配制。通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)法[12]在顯微鏡下數(shù)細(xì)胞，保證接入的藻液終濃度一致，細(xì)胞數(shù)約1×106～1×108個(gè)/mL左右，每種處理4～5瓶，于25 ℃，16 h光照（1 000～3 000 lx），8 h黑暗進(jìn)行震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每24 h取樣1次，使用酶標(biāo)儀測(cè)量缺氮、缺硫條件下CC124和CC425藻液在490 nm處的吸光值，且每組實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)平行，根據(jù)生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線得藻株每日的生物量，并繪制藻株的生長(zhǎng)曲線。

（2）藻株增長(zhǎng)曲線繪制及其油脂含量。利用尼羅紅染色法測(cè)量油脂含量[13]首先繪制三酰甘油濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。在藻株培養(yǎng)的第48小時(shí)，取適當(dāng)藻液進(jìn)行離心、富集，取10 μL藻液加入0.2 μL 0.1 mg/mL尼羅紅染料和1.8 μL DMSO孵育10 min，分別測(cè)量在染色前后的吸光值，且每個(gè)樣設(shè)置5個(gè)平行。根據(jù)三酰甘油濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每日的油脂含量，繪制油脂增長(zhǎng)曲線。

（3）藻株?duì)顟B(tài)及油滴觀察。將以上培養(yǎng)的藻株在培養(yǎng)的2～3 d 時(shí)，對(duì)三角瓶中藻液的外觀狀態(tài)拍照。取10 μL的藻液制片，并加入1 μL的魯格式碘液固定細(xì)胞，使用濃度為0.2 μL 0.1 mg/mL的尼羅紅染色10 min，使用熒光顯微鏡進(jìn)行白光和熒光對(duì)油滴進(jìn)行觀察和拍照[14]。

1.2.2 相關(guān)基因引物設(shè)計(jì)及Real Time PCR

（1）藻種RNA的提取及cDNA合成。參照李亞軍等[8]RNA提取方法分別提取CC124和CC425第1、2、3、4天的動(dòng)態(tài)RNA，并將提取的RNA進(jìn)行變性和反轉(zhuǎn)錄，用于Real Time PCR的模板。

（2）引物的設(shè)計(jì)及合成。此次Real Time相關(guān)引物用Primer Premier5進(jìn)行設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的引物信息見表1[引物均為委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。

（3）SYBR實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。以連續(xù)4 d提取出的RNA做模板和以上合成的引物，每組設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用SYBR Premix Ex Taq（TakaRa）實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行動(dòng)態(tài)熒光定量PCR檢測(cè)，總反應(yīng)體系為16 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）7.5 μL，ROX Reference Dye（50×）0.3 μL，PCR正向引物1 μL，PCR反向引物1 μL，模板1 μL，雙蒸水5.2 μL，每組設(shè)3個(gè)平行，擴(kuò)增條件為95 ℃反應(yīng)1 min；95 ℃反應(yīng)20 s和58 ℃反應(yīng)20 s，循環(huán)40次。內(nèi)參為：18S rRNA。

2 結(jié)果與分析

2.1 萊茵衣藻CC124和CC425在缺氮、缺硫條件下生理生化指標(biāo)

2.1.1 藻株在缺氮、缺硫條件下生物量變化 由圖1、2可以看出，缺氮、缺硫的環(huán)境均使藻株的生物量下降，培養(yǎng)3～4 d，兩種逆境條件都使藻株生物量下降2～3倍。差異極顯著（通過SPSS軟件分析，p<0.01差異極顯著），說明缺氮、缺硫環(huán)境對(duì)萊茵衣藻的生長(zhǎng)抑制作用很明顯。

2.1.2 藻株在缺氮、缺硫條件下油脂含量變化

在測(cè)量生物量的同時(shí)，對(duì)藻株每日的油脂含量進(jìn)行測(cè)量，由圖3、4可以看出，缺氮、缺硫的環(huán)境有益于萊茵衣藻CC124、CC425油脂的積累，藻株培養(yǎng)3～4 d，在缺氮的條件下，相對(duì)于正常培養(yǎng)的CC124藻株油脂量積累增加了5～10倍，缺硫處理也能導(dǎo)致CC425藻株油脂含量增加5～6倍，差異極顯著（p<0.01）。

2.1.3 藻株在缺氮、缺硫條件下藻狀態(tài)及油滴顯微拍照 由圖5可以看出，缺氮、缺硫的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致藻液顏色變黃，其中原因之一也有可能與圖1、2中藻株在缺氮、缺硫環(huán)境下生物量較少有關(guān)，并且與對(duì)照相比，油滴積累明顯增多。熒光暗場(chǎng)照片中黃色熒光代表以三酰甘油為主的中性脂。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

2.2.1 與氮同化相關(guān)的基因在正常與缺氮條件下mRNA的表達(dá)水平 由圖6可以看出，在缺氮水平較正常條件相比，NAR3和NAR1.1這2個(gè)基因基因表達(dá)量明顯上升，最高能增高200倍左右；同時(shí)，NII1基因能較高水平地增高表達(dá)量，最高能到30倍左右；NIA1、NIT2、AOX1基因低水平地提高表達(dá)量，約1～10倍之間，其中NIA1前兩天其mRNA表達(dá)量較正常要低，經(jīng)過3～4 d的培養(yǎng)之后，缺氮條件開始較正常表達(dá)量高。說明實(shí)驗(yàn)的這6個(gè)基因在缺氮條件下表達(dá)量均升高，并且NAR3、NAR1.1促進(jìn)效果更為顯著。

2.2.2 與硫同化相關(guān)的基因在正常與缺硫條件下mRNA的表達(dá)水平 由圖7可以看出，在缺硫條件下較正常相比，SLT1、ARS1、SULTR2、ATS1這4個(gè)基因mRNA表達(dá)量有很明顯的提高，其中SLT1增高了1 000～2 000倍，SULTR2也最高能增高450倍的表達(dá)量，ARS1、ATS1提高10～30倍，SULP1、SIR1的表達(dá)量提高了約2～5倍左右。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)微藻產(chǎn)油相關(guān)報(bào)道，氮、硫同化相關(guān)的基因可能與油脂積累有間接的關(guān)系[31]，對(duì)TAP或者HSM培養(yǎng)基進(jìn)行缺氮和缺硫處理，會(huì)導(dǎo)致萊茵衣藻中三酰甘油的大量聚集。實(shí)驗(yàn)中的圖1～5也可以看出在缺氮、缺硫的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致藻液狀態(tài)變黃，較正常相比，缺氮缺硫條件下的藻株油脂的積累明顯增高。由此筆者對(duì)氮、硫同化通路里典型的基因進(jìn)行表達(dá)研究。實(shí)驗(yàn)根據(jù)2-△△CT相對(duì)定量法通過計(jì)算得到目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量[32]，系統(tǒng)地把多個(gè)基因一起進(jìn)行分析，方便快捷地得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。從圖6和圖7中可以直觀地看出缺氮、缺硫能夠促進(jìn)萊茵衣藻中氮同化或硫同化相關(guān)基因的表達(dá)。在圖6所示的缺氮環(huán)境中，NAR3和NAR1.1較對(duì)照mRNA表達(dá)量顯著提高，最高能達(dá)200倍，在圖7所示的缺硫環(huán)境中，SLT1較對(duì)照有1 000～2 000倍的mRNA表達(dá)量，SULTR2也最高能增高450倍的表達(dá)量。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)基因均分別是萊茵衣藻氮和硫的轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因，說明在缺氮，缺硫的條件對(duì)相應(yīng)元素轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的表達(dá)還是有著很大的影響。NAR在高等植物中受NO3-的誘導(dǎo)表達(dá)[33]，在N通路中發(fā)揮很重要的作用。在擬南芥缺硫狀態(tài)下研究發(fā)現(xiàn)，高親和性運(yùn)輸載體對(duì)硫的應(yīng)答是受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，尤其是在長(zhǎng)時(shí)間的缺硫狀態(tài)下，表達(dá)量明顯升高[34]。運(yùn)載體在植物對(duì)礦物質(zhì)元素吸收的過程中作用關(guān)鍵，本研究只是初步對(duì)相關(guān)的基因做了定量分析，而上述基因是否真正與油脂代謝有聯(lián)系，還需要通過對(duì)相關(guān)基因的缺失或過量表達(dá)進(jìn)行分析，深入研究這些基因?qū)θR茵衣藻中與油脂積累的影響才能得出結(jié)論。

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