黃麗芳 董云萍 王曉陽 陳鵬 林興軍 范睿 閆林

摘 要 通過引物篩選獲得18條RAPD多態(tài)性引物，利用該引物對(duì)72份咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增出149條條帶，其中多態(tài)性條帶126條，多態(tài)性位點(diǎn)為84.6%。運(yùn)用UPGMA方法構(gòu)建了聚類圖，在相似系數(shù)0.632的水平下可將72份資源聚為3個(gè)大類，其中A類群包含了所有的中粒種資源（Coffea canephora Pierre）及一份由云南德宏所選育的中小粒種雜交種（阿拉伯斯塔），共34份咖啡種質(zhì)資源；B類群包括了6份查理種（Coffea excelsa Chevalier）和大粒種（Coffea liberica Bull ex Hiern）；C類群由小粒種（Coffea arabica. Linne）咖啡組成。結(jié)果說明咖啡種質(zhì)的遺傳關(guān)系種間容易劃分，在種的分類水平上存在遺傳關(guān)系多樣性，部分資源的分類學(xué)地位與地理來源無相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 咖啡；RAPD；遺傳多樣性

中圖分類號(hào) S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

咖啡與可可、茶同列世界三大飲料作物，其主要栽培品種為小粒種（C. arabica L .）和中粒種（C. canephora Pierre）。另外的2個(gè)品種大粒種（C. liberica Bull ex Hiern）和查理種（C. excelsa Chevalier），因品質(zhì)較差，很少作為商業(yè)栽培。目前，咖啡已是許多地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。國(guó)內(nèi)咖啡主產(chǎn)區(qū)在云南和海南，已在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所及云南德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所建立了咖啡種質(zhì)圃，收集了從墨西哥、喀麥隆、馬來西亞等地引進(jìn)的咖啡種質(zhì)200多份。因種質(zhì)資源多為外引的栽培品種或大田選擇的變異單株，因而種質(zhì)資源相對(duì)匱乏，遺傳基礎(chǔ)狹窄，且中國(guó)對(duì)咖啡種質(zhì)的鑒定評(píng)價(jià)研究較淺，還未開展對(duì)咖啡種質(zhì)資源遺傳特性的研究，致使咖啡新品種選育速度緩慢。

分子標(biāo)記是一種快速高效的遺傳分析方法，可有效排除環(huán)境因素和觀察標(biāo)準(zhǔn)的誤差。國(guó)外利用RAPD、AFLP、SRAP、SSR和EST-SSR等技術(shù)針對(duì)小粒種或中粒種咖啡進(jìn)行主栽品種、雜交群體的遺傳特性、遺傳關(guān)系以及品種的鑒定[2-5]。中國(guó)學(xué)者莫饒[6]用11對(duì)SSR引物構(gòu)建了12份咖啡品種的SSR指紋圖譜，但許多品種資源的分類地位及親緣關(guān)系尚不清楚，不利于進(jìn)一步利用現(xiàn)有資源開展育種工作。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA， RAPD），是研究遺傳多樣性的有力工具，比AFLP、SRAP操作簡(jiǎn)便、快捷、成本低，比SSR產(chǎn)物多態(tài)性豐富，具有擴(kuò)增多態(tài)性好，靈敏度高，對(duì)DNA序列不要求了解等優(yōu)點(diǎn)[7-10]。RAPD標(biāo)記不足之處就是受反應(yīng)條件影響較大，檢測(cè)的重復(fù)性較差，使得不同研究者的研究結(jié)果難以比較，但可以通過建立一個(gè)穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的RAPD-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以及反復(fù)試驗(yàn)，選擇重復(fù)性好的條帶錄入數(shù)據(jù)，即可克服重復(fù)性差的弱點(diǎn)，增加試驗(yàn)的可靠性[11]。Anthony等[12]利用RAPD標(biāo)記研究了埃塞俄比亞咖啡起源中心代表88份種質(zhì)的119株小粒種咖啡的遺傳多樣性，用29個(gè)多態(tài)性片段計(jì)算相似性指數(shù)和構(gòu)建“樹狀圖”。本研究對(duì)收集到的72份咖啡資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，利用RAPD技術(shù)分析了咖啡種質(zhì)資源親緣關(guān)系，為鑒定咖啡種質(zhì)資源遺傳性狀、篩選適宜的雜交親本、核心種質(zhì)的建立提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

72份咖啡種質(zhì)資源見表1，其中中粒種資源32份，小粒種32份，大粒種3份，查理種3份，中小粒種雜交種1份，還有1份來自福建的資源分類不明確。編號(hào)1-61，67-72取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所咖啡種質(zhì)資源圃（海南興?。?，其中編號(hào)1-19為該所選育的高產(chǎn)無性系，編號(hào)62-66取自海南省澄邁縣。72份材料分別來源于中國(guó)云南、海南等5省份，以及喀麥隆、墨西哥等11個(gè)國(guó)家。試驗(yàn)于2012年在農(nóng)業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，選取健康植株上的無病蟲害成熟葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 基因組DNA的提取參照黃麗芳等[13]的CTAB改良法。提取的基因組DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量，稀釋至20 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選及RAPD擴(kuò)增 選取RAPD引物S1-S100共100條隨機(jī)引物。利用4份差異較大的咖啡（27號(hào)、臺(tái)灣小粒、大粒、M10）模板進(jìn)行引物篩選，選取多態(tài)性好且擴(kuò)增條帶清晰的引物用于本試驗(yàn)。使用郎基LK200梯度PCR儀進(jìn)行RAPD反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為本課題組優(yōu)化過的咖啡RAPD反應(yīng)體系[14]：基因組DNA 20 ng，dNTPs 0.3 mmol/L，Taq酶1.25 U，Mg2+ 1.5 mmol/L，引物0.6 μmol/L，10×buffer 2 μL，雙蒸水補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，38 ℃ 1.75 min，72 ℃延伸2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物加入3 μL溴酚藍(lán)，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)引物擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中遷移率的不同，對(duì)電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)。相同遷移位置，重復(fù)性、清晰度好的擴(kuò)增條帶賦值“1”，無條帶或肉眼不易分辨的弱帶賦值“0”，采用NTSYSpc 2.1軟件，根據(jù)Nei和Li相似系數(shù)計(jì)算遺傳相似系數(shù)GS（genetic similarity），根據(jù)非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD引物篩選與擴(kuò)增片段多態(tài)性

通過4份性狀差異較大的咖啡品系擴(kuò)增（圖1），從100條RAPD隨機(jī)引物中篩選出18條多態(tài)性好且擴(kuò)增條帶清晰的引物。

利用篩選出的18條引物對(duì)72份咖啡材料進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，共擴(kuò)增得到149條DNA條帶（表2），多態(tài)性帶126條，占所觀察到總擴(kuò)增帶的84.6%。不同引物擴(kuò)增獲得的多態(tài)性條帶數(shù)量在4～12條之間，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出7條多態(tài)性條帶，各條引物檢測(cè)到的多態(tài)性條帶比例為62.5%～100%，擴(kuò)增條帶分子量多數(shù)為500～1 800 bp。其中引物S19擴(kuò)增出12個(gè)位點(diǎn)的條帶，擴(kuò)增條帶數(shù)最多，多態(tài)性比率為100%（圖2）；引物S25、S28、S46、S75擴(kuò)增總帶數(shù)最少，為6條。

2.2 遺傳相似系數(shù)

72份咖啡資源的遺傳相似系數(shù)在0.364 4～0.974 6之間。根據(jù)遺傳相似系數(shù)可知不同種質(zhì)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，從表3可以看出，所有種質(zhì)間均有不同程度的遺傳差異。興33和云南貢山-2的遺傳相似系數(shù)最?。?.364 4），表明遺傳距離最遠(yuǎn)，遺傳差異最大；興2小粒種和CTM19的遺傳相似系數(shù)最大（0.974 6），表明遺傳距離最近，遺傳差異最小。同一種質(zhì)資源內(nèi)個(gè)體間也存在不同程度的差異，其中石壟坡個(gè)體間差異最大，個(gè)體間平均遺傳相似系數(shù)為0.529 7，個(gè)體間最小遺傳相似系數(shù)為0.423 7，最大遺傳相似系數(shù)為0.923 7。而卡蒂莫（巴西）個(gè)體間差異最小，平均遺傳相似系數(shù)為0.679 7，個(gè)體間最小遺傳相似系數(shù)為0.432 2，最大遺傳相似系數(shù)為0.957 6。

2.3 聚類分析

聚類分析顯示，在相似系數(shù)0.632水平下，全部材料可以分為3大類，A類群包括來自海南興隆、越南、巴布亞新幾內(nèi)亞、馬來西亞、泰國(guó)、印尼、福建的全部中粒種資源，以及一份由云南德宏所選育的中小粒種雜交種（阿拉伯斯塔），共34份咖啡種質(zhì)資源；B類群包括了來自海南文昌和興隆的6份查理種和大粒種；C類群包括了來自巴西、墨西哥、馬來西亞、印度、喀麥隆、哥倫比亞、葡萄牙、廣西、云南德宏、海南的32份小粒種咖啡（圖3）。

A類群由全部供試的中粒種種質(zhì)組成，在相似系數(shù)為0.675時(shí)，一份來自福建的種質(zhì)單獨(dú)成為一分支，其他的33份資源在0.726為相似系數(shù)時(shí)又分為兩個(gè)支，來自海南興隆、越南、馬來西亞、泰國(guó)等地的咖啡資源聚為一類，阿拉伯斯塔、印尼及一份來自巴布亞新幾內(nèi)亞的資源聚為另一類。

B類群的種質(zhì)受來源地的影響較為顯著，遺傳相似系數(shù)范圍為0.705～0.958。在0.915為截值時(shí)，來自海南文昌的南頂、大粒種和石壟坡聚為一類，與查理小果、查理大果在0.871截值時(shí)聚為一個(gè)分支，而查理中果則在0.705時(shí)與其他5份種質(zhì)進(jìn)行聚類。

C類群包含了全部的小粒種咖啡，在相似系數(shù)0.748時(shí)，分為2個(gè)分支，其中一支有來自臺(tái)灣南部、臺(tái)灣中部、云南貢山-1和云南貢山-2，共4份種質(zhì)；另一分支有來自巴西、喀麥隆、廣西等地共28份種質(zhì)。

3 討論

通過分析發(fā)現(xiàn)，72份咖啡資源分為3大類，相似系數(shù)0.364 4～0.974 6之間，說明這些材料遺傳基礎(chǔ)相對(duì)較寬，存在較大的遺傳變異性。

A類群遺傳相似系數(shù)范圍在0.675～0.898之間，種內(nèi)遺傳多樣性較豐富，遺傳背景較復(fù)雜。這可能與中粒種咖啡是異花授粉有關(guān)，在長(zhǎng)期的繁殖過程中，產(chǎn)生并積累了大量的不連續(xù)變異。Hamrick等[15]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，多年生異花授粉植物具有較高水平遺傳多樣性，在種內(nèi)水平上這種現(xiàn)象尤為明顯。

Anthony等[16]用37對(duì)AFLP引物和6對(duì)SSR引物研究了26份栽培和半野生小粒種的遺傳多樣性，結(jié)果表明，AFLP和SSR的聚類情況相似，半野生小粒種的多態(tài)性較栽培種的高，但總體的遺傳基礎(chǔ)較窄，本研究中也發(fā)現(xiàn)，小粒種咖啡的親緣關(guān)系較緊密，遺傳相似系數(shù)為0.748～0.974，遺傳多樣性不明顯。聚類分析表明，A、B、C類群種間關(guān)系清晰，查理種、大粒種、中粒種及小粒種聚類得到的結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果較為一致。

咖啡資源的遺傳關(guān)系與資源來源地有關(guān)，與植物學(xué)分類學(xué)特性、長(zhǎng)期的人工種植、栽培環(huán)境、果實(shí)的大小、用途等[17-20]具有一定的相關(guān)性。72份資源的聚類結(jié)果表明，不同國(guó)家（地區(qū)）咖啡資源有聚在一起的趨勢(shì)，但也有材料偏離所屬國(guó)家（地區(qū)）的現(xiàn)象，如C類群的小粒種資源，臺(tái)灣南部、臺(tái)灣中部和云南貢山的2份資源聚為一個(gè)分枝，而臺(tái)灣小粒種在另一分枝，差異較大，說明同一地區(qū)的種質(zhì)間存在遺傳差異。導(dǎo)致劃分的類群與其來源地相關(guān)性不明顯的原因，可能是廣泛的種質(zhì)起源以及漫長(zhǎng)的進(jìn)化，也可能是長(zhǎng)期人工選育的結(jié)果[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)咖啡的遺傳關(guān)系若僅由種質(zhì)材料來源區(qū)域的遠(yuǎn)近和生產(chǎn)上品種的名稱、外形來判斷無疑難以得到確切的分類信息。通過RAPD標(biāo)記分析結(jié)果表明，72份咖啡資源存在遺傳差異，種間容易劃分，但在種內(nèi)分類水平上，小粒種遺傳關(guān)系較緊密，多樣性不明顯，而中粒種咖啡遺傳多樣性豐富，與小粒種咖啡有明顯的區(qū)別。此外，研究還表明部分咖啡資源的遺傳關(guān)系與其地理來源并無相關(guān)性，這也反映了咖啡產(chǎn)地對(duì)其分類學(xué)地位的影響不顯著。

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責(zé)任編輯：趙軍明