童曉潔　蘭澤棟　鄭雅心等

[摘要]目的：探討大鼠牙胚細(xì)胞（Tooth germ cells， TGC）與骨形成蛋白-2 （Bone morphogenetic proteins-2，BMP-2）聯(lián)合作用對(duì)人牙周膜干細(xì)胞（Human periodontal ligament stem cells， hPDLSCs）向成牙骨質(zhì)細(xì)胞表型分化的作用。方法：將免疫磁珠法分離的hPDLSCs與TGC共培養(yǎng)，并加入50ng/mL的BMP-2，通過RT-PCR， 茜素紅染色和堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase， ALP）活性檢測(cè)等方法分析其相關(guān)成牙骨質(zhì)基因及蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果：誘導(dǎo)后hPDLSCs 的ALP活性明顯升高（P<0.001），牙骨質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因如牙骨質(zhì)附著蛋白（Cementum attachment protein，CAP）、牙骨質(zhì)蛋白（Cementum protein1，CEMP-1）、ALP，骨鈣素（Osteocalcin，OCN）的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量均有不同程度的增高（P<0.001）。礦化誘導(dǎo)14d后，誘導(dǎo)組形成大量礦化結(jié)節(jié)，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)論：TGC與BMP-2聯(lián)合作用能夠誘導(dǎo)hPDLSCs與向成牙骨質(zhì)細(xì)胞的表型分化。

[關(guān)鍵詞]牙周膜干細(xì)胞；骨形成蛋白-2；成牙骨質(zhì)細(xì)胞；牙胚細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]R246.83 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2014）16-1343-06

Abstract： Objective To investigated the role of Bone morphogenetic protein-2 （BMP-2） as a factor to induce human periodontal ligament stem cells （hPDLSCs） differentiate into cementoblast or cementum like cells when co-cultured with tooth germ cells（TGC）. Methods hPDLSCs isolated by magnetic-activated method. The cells were co-cluture with tooth germ cells （control group） or co-cultured with tooth germ cells containing BMP-2（test group）.Then RT-PCR， Alkaline Phosphatase （ALP） analyses and mineralization assay were used to identify the cementoblast markers， such as CAP（Cementum attachment protein），CEMP-1（Cementum protein1），ALP and OCN （Osteocalcin）. Results The induced cells showed high ALP activity （P<0.001）， increased calcified nodules formation（P<0.001） and a significantly increase cementum-related genes expression such as CEMP-1，CAP，ALP and OCN （P< 0.001）. Conclusion hPDLSCs co-culture with TGC containing bone morphogenetic proteins-2 acquired more cementoblast features.

Key words：periodontal ligament stem cells； bone morphogenetic protein-2；cementoblast； tooth germ cells

牙骨質(zhì)是覆蓋在牙根表面的一薄層礦化組織，當(dāng)牙骨質(zhì)發(fā)生吸收或破壞時(shí)其自我修復(fù)能力有限，定向誘導(dǎo)hPDLSCs分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞使牙骨質(zhì)再生是牙周組織工程的重要內(nèi)容。微環(huán)境[1]和細(xì)胞因子在牙周膜干細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮著重要的作用，本研究擬將細(xì)胞因子和微環(huán)境聯(lián)合作用來誘導(dǎo)hPDLSCs向成骨質(zhì)細(xì)胞分化，為牙骨質(zhì)的再生提供一些理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：主要試劑：α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，USA），胎牛血清（FBS， Gibco， USA），胰蛋白酶（Gibco， USA），Ⅰ型膠原酶（Sigma，USA）， Dispase酶（Sigma，USA），免疫磁珠試劑盒 （Dynal biotech，USA），小鼠抗人STRO-1單克隆抗體、小鼠抗人CD146單克隆抗體、小鼠抗人角蛋白多克隆抗體、小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體（Life Technologies，USA）；Hoechst（Sigma，USA）；BMP-2（Peprotech，USA）； ALP試劑盒（南京建成生物工程研究所）。主要儀器：倒置顯微鏡（Olympus， Japan）；免疫熒光顯微鏡（Leica Japan）；Real- time PCR 儀（Bio-Rad， USA）； 磁力架（Dynal biotech，USA）；Transwell （Milliport，USA）。

1.2 hPDLSCs的培養(yǎng)與分離[2]：遵循知情同意原則收集臨床上因正畸需要拔除的牙周健康無齲的前磨牙，PBS反復(fù)沖洗牙齒，11號(hào)刀片快速刮下根中1/3部分的牙周膜，加入3mg/mL的Ⅰ型膠原酶和4mg/mL的Dispase酶，37℃消化1h， 70μm濾膜過濾器獲得單細(xì)胞懸液， 將細(xì)胞接種于含10%FBS，2mmol/L L-谷氨酰胺和100μmol/L 維生素C的α-MEM培養(yǎng)基中， 37℃，5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，每3天換液，細(xì)胞生長達(dá)80%時(shí)傳代，取第2代牙周膜細(xì)胞，根據(jù)免疫磁珠試劑盒說明書分離hPDLSCs并擴(kuò)增。

1.3 hPDLSCs的鑒定：采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì) hPDLSCs進(jìn)行鑒定。將經(jīng)磁珠法篩選獲得的 hPDLSCs（+）和 hPDLSCs（-）細(xì)胞分別制作細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，PBS清洗，1%BSA室溫封閉30min，阻斷非特異性結(jié)合，分別滴加STRO-1、CD146、角蛋白和波形蛋白一抗以及PBS，4℃孵育過夜。PBS沖洗，滴加熒光二抗，37℃染色45min，Hoechst染色5min，PBS清洗后熒光封片劑封片，免疫熒光顯微鏡下觀察。

1.4鼠TGC的制備：選用5只出生后8天的Sprauge-Dawley大鼠，斷頸處死，分離出下頜骨，體視顯微鏡下取出下頜骨中4個(gè)第一磨牙牙胚，去掉牙釉質(zhì)，將牙胚組織剪碎后加入3mg/mL的 I型膠原酶和4mg/mL Dispase酶，37℃消化1h。將細(xì)胞接種于含10%FBS，2mmol/L L-谷氨酰胺和100μmol/L 維生素C的α-MEM培養(yǎng)基中，37℃，5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，2～3天換液.細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)備用。

1.5 hPDLSCs向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的定向誘導(dǎo)：誘導(dǎo)組將TGC和第3代hPDLSCs以2×105/mL接種至六孔板和Transwell進(jìn)行共培養(yǎng)并加入含50ng/mL BMP-2的α-MEM培養(yǎng)基；對(duì)照組不加50ng/mL BMP-2，每隔1天換液。

1.6 ALP活性檢測(cè)：分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組3，6，9d的細(xì)胞依照ALP試劑盒說明書進(jìn)行ALP活性檢測(cè)。

1.7 RT-PCR檢測(cè)：分別收集誘導(dǎo)組和對(duì)照組3d的細(xì)胞，按照Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù) LightCycler R 480 SYBR Green I Master反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)CAP、OCN、ALP、CEMP-1基因的表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參照，引物設(shè)計(jì)見表1，由英偉創(chuàng)津公司合成。

1.8 茜素紅染色：按上述分組將hPDLSCs以2×105/mL密度接種至誘導(dǎo)組和對(duì)照組，培養(yǎng)基中添加含10mmol/L的β-甘油磷酸鈉進(jìn)行礦化誘導(dǎo)，每隔2d換液，連續(xù)培養(yǎng)14d后， 4%多聚甲醛常規(guī)固定，PBS清洗，加入 0.1%茜素紅染色30min后去除染色液，PBS潤洗，相差顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，然后用含5% 十二烷基硫酸鈉（SDS）的0.5N 鹽酸溶液溶解著色的礦化結(jié)節(jié)30min，溶解液稀釋10倍移至96孔板中，405nm波長測(cè)各孔吸光值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1原代培養(yǎng)的PDLSCs，第2天開始出現(xiàn)貼壁生長，細(xì)胞多為長梭形，少量星形細(xì)胞，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，核圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，5～6天即可達(dá)到瓶底覆蓋率的80%（A）。經(jīng)免疫磁珠分離的hPDLSCs胞漿被大量磁珠緊密包裹，貼壁生長2～3天后細(xì)胞伸展呈長梭形，磁珠貼合在細(xì)胞表面，不影響細(xì)胞生長，吹打或沖洗細(xì)胞以及傳代后磁珠依然不脫落（ B），如圖1。

2.2 hPDLSCs的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果示hPDLSCs（+）表達(dá)早期間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1（A）和血管周圍細(xì)胞標(biāo)志分子CD146（B）；hPDLSCs（-）不表達(dá)（C）和（D）。PDLSCs（+）和PDLSCs（-）細(xì)胞胞漿波形蛋白抗體染色均為陽性（E），角蛋白抗體染色均為陰性（F），說明所有細(xì)胞來源于間充質(zhì)組織沒有上皮細(xì)胞的污染。PBS染色的對(duì)照組里沒有見到任何染色的細(xì)胞（G），說明篩選結(jié)果具有可靠性（如圖2）。

2.3鼠TGC的制備，體視顯微鏡下出生后8天的SD大鼠下頜第一磨牙牙胚（A），倒置顯微鏡下觀察到呈鵝卵石樣的上皮來源細(xì)胞（B）和類似紡錘樣的間充質(zhì)來源細(xì)胞（C），及兩種細(xì)胞的交界處（D）（如圖3）。

2.4 ALP活性檢測(cè)顯示和對(duì)照組相比，經(jīng)BMP-2和TGC聯(lián)合誘導(dǎo)后，hPDLSCs的ALP活性明顯升高（如圖4）。

2.5 RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的hPDLSCs，牙骨質(zhì)相關(guān)基因CAP、CEMP-1、ALP 和OCN的表達(dá)量較對(duì)照組均有明顯升高，其中CEMP-1和ALP升高最明顯（如圖5）。

2.6 茜素紅染色，將誘導(dǎo)組和對(duì)照組分別添加β-甘油磷酸鈉礦化誘導(dǎo)14天后，誘導(dǎo)組表面形成大量的礦化結(jié)節(jié)（B），非誘導(dǎo)組僅有少量的礦化結(jié)節(jié)形成（A）。兩組相比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（C）（如圖6）。

3 討論

PDLSCs是牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨再生的前體細(xì)胞[3]，是牙周組織再生的種子細(xì)胞[4]，干細(xì)胞的定向分化需要特殊的微環(huán)境和相關(guān)信號(hào)分子的聯(lián)合作用[1，5]。如何有效誘導(dǎo)hPDLSC定向分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞是牙骨質(zhì)再生的研究難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

目前，關(guān)于牙骨質(zhì)再生的研究主要集中在利用各種細(xì)胞因子的單向誘導(dǎo)作用，如牙本質(zhì)非膠原蛋白（dentin non-collagen protein， DNCPs），BMP-2，釉基質(zhì)蛋白衍生物（Enamel Matrix Derivative， EMD）等，并無法真正模擬成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的微環(huán)境[6-9]。牙根發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，在牙根發(fā)育過程中，當(dāng)根部牙本質(zhì)形成時(shí)，包繞牙根的上皮根鞘斷裂成網(wǎng)狀，牙囊細(xì)胞穿過斷裂的根鞘上皮，進(jìn)入新形成的牙本質(zhì)表面分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞。這個(gè)過程涉及復(fù)雜的調(diào)控信號(hào)，如上皮和間充質(zhì)細(xì)胞間的交流信號(hào)，牙囊細(xì)胞和牙本質(zhì)的接觸信號(hào)等，為此越來越多的學(xué)者認(rèn)為根端牙胚微環(huán)境在牙根發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，有研究認(rèn)為[10]，根端牙胚細(xì)胞培養(yǎng)液可以作為hPDLSCs向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的微環(huán)境，誘導(dǎo)后的hPDLSCs成骨或成牙骨質(zhì)相關(guān)基因ALP和I型膠原酶（Type I collagen，Col I）的表達(dá)量明顯增加，但牙骨質(zhì)特異性蛋白CEMP-1和對(duì)照組相比沒有明顯變化，也沒有發(fā)現(xiàn)骨涎蛋白（Bone sialoprotein， BSP）和OCN的表達(dá)。由此我們推測(cè)根端牙胚細(xì)胞是一個(gè)復(fù)合細(xì)胞群，含有上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，它們一起混合培養(yǎng)是一個(gè)上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞交流的過程，可以為成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化提供一定的微環(huán)境，但可能還需要更多的牙囊和牙本質(zhì)的接觸信號(hào)和其他相關(guān)信號(hào)因子的參與來彌補(bǔ)單一微環(huán)境或單一細(xì)胞因子誘導(dǎo)hPDLSCs向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的不足。BMP信號(hào)通路被認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄水平參與了PDLSCs向成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化[11]，BMP-2，4，7會(huì)在上皮和間充細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，介導(dǎo)上皮和間充質(zhì)之間的信號(hào)交流。許多研究[12-13]已報(bào)道BMP-2可促進(jìn)牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周韌帶的再生。BMP-2可以誘導(dǎo)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞（牙囊細(xì)胞）向成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化并刺激細(xì)胞表達(dá)牙骨質(zhì)標(biāo)志性蛋白CAP和（或）CEMP-1[14，7]，也可以誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞中的祖細(xì)胞表達(dá)CAP，并認(rèn)為BMP-2的最佳有效濃度是50ng/mL[15 ]。

利用根端牙胚作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)，根端牙胚的制取復(fù)雜，根端牙胚的界限也值得商榷，所得由牙囊細(xì)胞，牙乳頭和上皮根鞘組成的根端牙胚細(xì)胞比例存在較大的人為因素的差異，所以本實(shí)驗(yàn)擬采用大鼠的整個(gè)牙胚細(xì)胞做為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，而不是只局限于根端組織，從而優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備方法，為其提供更多的牙囊牙本質(zhì)接觸信號(hào)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，出生后8天的大鼠牙胚亨廷頓上皮根鞘（Hertwig's epithelial root sheath，HERS）開始向根端延伸形成上皮根鞘，將牙囊細(xì)胞和牙乳頭細(xì)胞分隔開，開始牙根的發(fā)育和形成，我們推測(cè)這個(gè)時(shí)期的牙胚細(xì)胞具有豐富的成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)，另外牙乳頭細(xì)胞可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，形成牙本質(zhì)及牙本質(zhì)基質(zhì)可以為我們提供更多的牙囊和牙本質(zhì)的接觸信號(hào)，因此本實(shí)驗(yàn)選用出生后8天的大鼠TGC，作為誘導(dǎo)微環(huán)境并添加50ng/mL的BMP-2誘導(dǎo)hPDLSCs向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化。

牙骨質(zhì)附著蛋白（CAP）[17-19]是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，表達(dá)于牙骨質(zhì)，牙周膜細(xì)胞和牙槽骨細(xì)胞，與成牙骨質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞遷移并附著至牙根表面有關(guān)，因而被稱為牙骨質(zhì)附著蛋白，是目前已被公認(rèn)的可以作為成牙骨質(zhì)細(xì)胞與成骨細(xì)胞鑒別的特異性標(biāo)志分子。CEMP1[20]作為一種成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化和類牙骨質(zhì)機(jī)制礦化局部調(diào)節(jié)因子只在成牙骨質(zhì)細(xì)胞和它的前體細(xì)胞及一些牙周膜細(xì)胞中表達(dá)，而在成骨細(xì)胞中不表達(dá)。它能促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)而抑制PDLSCs向成骨細(xì)胞分化[21]。ALP[22]作為一種牙源性間充質(zhì)細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞/成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，也是反應(yīng)礦化形成細(xì)胞功能狀態(tài)的重要指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，通過TGC和BMP-2的聯(lián)合作用可以誘導(dǎo)hPDLSCs表達(dá)CAP、CEMP-1這兩種牙骨質(zhì)特異性基因，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），同時(shí)OCN和ALP的表達(dá)量較非誘導(dǎo)組也有了明顯的升高（如圖5）。ALP活性檢測(cè)結(jié)果也從蛋白水平說明誘導(dǎo)組的ALP活性較對(duì)照組顯著增高見（P<0.001），如圖4；另外經(jīng)過14天的礦化誘導(dǎo)，誘導(dǎo)組的礦化能力與對(duì)照組相比也有明顯的升高見（如圖6）。由此可見，TGC為hPDLSCs向成牙骨質(zhì)細(xì)胞的定向分化提供了一個(gè)適宜的微環(huán)境，BMP-2作為信號(hào)分子介導(dǎo)了上皮和間充質(zhì)之間的信號(hào)傳導(dǎo)，從而使hPDLSCs表達(dá)成牙骨質(zhì)細(xì)胞表型。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Sprading A，Drummond-Barbosa D，Kai T. Review article Stem cells find their niche[J].Nature，2001，414（6859）：98-104.

[2]張鳳秋，孟煥新，丁茜，等.人牙周膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及超微結(jié)構(gòu)觀察[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2014，46（2）：274-277.

[3]Seo，Batouli P，Brahim S，et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J]. The Lancet，2004，364（1429）：149-155.

[4]Menicanin D，Mrozik KM，Wada N，et al. Periodontal- ligament-derived stem cells exhibit the capacity for long-term survival，self-renewal， and regeneration of multiple tissue types in vivo[J].Stem Cells Dev，2014，23（9）：1001-1011.

[5]Dapeng L，Xiaojie L，Ping G，et al.Erk1/2 signalling is involved in the differentiation of periodontal ligament stem cells to Schwann cells in dog[J]. Arch Oral Biol， 2014， 59（5）：487-491.

[6]Wu J，Jin F，Tang L，et al.Dentin non-collagenous proteins （dNCPs） can stimulate dental follicle cells to differentiate into cementoblast lineages[J].Biology of the Cell，2008，100（5）： 291-302.

[7]Kémoun P，Laurencin-Dalicieux S，Rue J， et al.Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives （EMD） in vitro[J].Cell Tissue Res，2007，329（2）：283-294.

[8]Hakki SS，Berry JE，Somerman MJ，et al.The effect of enamel matrix protein derivative on follicle cells in vitro[J].Periodontol， 2000，72（5）：679-687.

[9]Tokiyasu T，Takata E，Saygin M，Somerman. Enamel factors regulate expression of genes associated with cementoblasts[J].Journal of Periodontal Research，2000，7（12）：1829-1839.

[10]Yang ZH，Zhang XJ，Dang，et al.Apical tooth germ cell-conditioned medium enhances the differentiation of periodontal ligament stem cells into cementum/periodontal ligament-like tissues[J].Journal of Periodontal Research，2009，44（2）：199-210.

[11]Aberg T，Wozney J，Thesleff I.Expression patterns of bone morphogenetic proteins（Bmps） in the developing mouse tooth suggest roles in morphogenesis and cell differentiation[J].Developmental Dynamics， 1997，210（4）：383-396.

[12]Choi SH，Kim CK，Cho KS.Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2/absorbable collagen sponge （rhBMP-2/ACS） on healing in 3-wall intrabony defects in dogs[J].Periodontol， 2002，73（1）：63-72.

[13]Talwar R，Di Silvio L，Hughes FJ.Effects of carrier release kinetics on bone morphogenetic protein-2-induced periodontal regeneration in vivo[J].Clin Periodontol， 2001，28（4）：340-347.

[14]Zhao M，Xiao G，Berry JE，et al.Bone morphogenetic protein 2 induces dental follicle cells to differentiate toward a cementoblast/osteoblast phenotype[J]. Journal of Bone and Mineral Research， 2002，17（8）：1441-1451.

[15]Pitaru S，Pritzki A，Bar-KanaI，et al. Bone morphogenetic protein 2 induces the expression of cementum attachment proteiin in human periodontal ligament clones[J].Connect Tissue Res， 2002， 43（2-3）：257-264.

[16]HuangXF，Bringas Jr P，Slavkin HC，et al. Fate of HERS during tooth root development[J].Developmental Biology，2009，334：22-30.

[17]Bar-Kana I，Savion N，Narayanan AS. Cementum attachment protein manifestation is restricted to the mineralized tissue forming cells of the periodontium[J].Eur J Oral Sci，1998，106（Suppl 1）：357-364.

[18]Arzate H，Olson SW，Page RC，et al Isolation of human tumor cells that produce cementum proteins in culture[J].Bone Miner， 1992，18（1）：15-30.

[19]BarKana I，Narayanan AS，Grosskop A，et al.Cementum attachment protein enriches putative cementoblastic populations on root surfaces in vitro[J].Dent Res，2000，79（7）： 1482-1488.

[20]Arzate H，Olson SW，Page RC，et al. Production of a monoclonal antibody to an attachment protein derived from human cementum[J].Federation of American Societies for Experimental Biology Journal， 1992，6（11）：2990-2995.

[21]Alvarez-PérezMA，NarayananS， Zeichner-David M，et al.Molecular cloning， expression and immunolocalization of a novel human cementum-derived protein （CP-23）[J].Bone，2006，38（3）：409-419.

[22]Fedde KN，Blair L，Silverstein J，et al. Alkaline phosphatase knock-out mice recapitulate the metabolic and skeletal defects of infantile hypophosphatasia[J]. Journal of Bone and Mineral Research，1999， 14（12）：2015-2026.

[收稿日期]2014-06-08 [修回日期]2014-07-20

編輯/何志斌