（天津生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300462）お

摘要 ［目的］克隆生防菌芽孢形成關(guān)鍵基因玸po0A啟動子P玸po0A，并檢測其特性。［方法］從生防菌B579 DNA中，經(jīng)PCR擴(kuò)增芽孢形成關(guān)鍵基因玸po0A啟動子P玸po0A，插入載體pGFP，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGFP睵玸po0A。［結(jié)果］重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，證明構(gòu)建正確，測序，結(jié)果與GenBank中的序列同源性為98%。［結(jié)論］該方法獲得了含有綠色熒光蛋白基因和芽孢形成關(guān)鍵基因玈po0A的重組質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究生防菌B579芽孢形成規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 生防菌；枯草芽孢桿菌；芽孢

中圖分類號 SB188文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06152-03

お

The Research of Spore Form Key Genes of Biocontrol 獴acillus subtilis B579

JIA Jun瞙ui

(Tianjin Vocational College of Bioengineering, Tianjin 300462)

Abstract ［Objective］ To clone and express the promoter of spore form key genes of 獴acillus subtilis and determine the property of expressed product. ［Method］ The promoter of spore form key genes spo0A of 獴. subtilis was amplified from chromosome DNA of 獴. subtilis by PCR and inserted into vector pGFP. The constructed recombinant secretory expression vector pGFP睵spo0A was transformed to B579 by Electrotransformation. ［Result］ Both restriction analysis and PCR proved that recombinant plasmid pGFP睵spo0A was constructed correctly. Sequencing result proved that the homology of nucleotide sequence of target gene was 98% to that reported in GenBank. ［Conclusion］ The study will lay a foundation for further study form law of biocontrol bacterium B579.

Key words Biocontrol bacterium; 獴acillus subtilis; Spore

お

作者簡介 賈鈞輝（1986- ），男，天津人，碩士研究生，研究方向：微生物制藥。

收稿日期 20140528

枯草芽孢桿菌是一種好氧、產(chǎn)芽孢、桿狀的革蘭氏陽性細(xì)菌，對人畜無毒無害，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力。許多性狀優(yōu)良的枯草芽孢桿菌生防菌株已經(jīng)進(jìn)行溫室或大田防治研究，對黃瓜［1］、辣椒［2］、水稻［3］、小麥［4］等農(nóng)作物病害顯出較好的防治效果。枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過程中有生成芽孢的特性，芽孢的大量生成會嚴(yán)重影響一些目的產(chǎn)物的生產(chǎn)和高濃度菌體的獲得。因此，在發(fā)酵中前期應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，及時檢測菌體生長狀態(tài)，預(yù)防過早生成芽孢，而在發(fā)酵后期應(yīng)促進(jìn)芽孢的生成，從而有利于高芽孢濃度菌劑的制備［5］。對于芽孢的形成就目前的研究進(jìn)展來看，主要是獳brB蛋白和spo0家族基因。spo0家族基因包括很多，如，spo0A，spo0B，spo0F等。spo0A是進(jìn)入芽孢階段重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是DNA復(fù)制的抑制劑［6］。孢子形成的起始被一個復(fù)雜集合體-蛋白激酶，磷酸化蛋白和磷酸酯酶所控制的。多組分物質(zhì)的磷酸化允許輸入和多重集合，不連續(xù)的新陳代謝和環(huán)境因子。這個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)輸出的決定性是玈po0A轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化。

課題組前期研究中篩選到的枯草芽孢桿菌B579，對多種常見的土傳病害表現(xiàn)出明顯防治效果［7］，具有良好的應(yīng)用前景。筆者利用基因工程技術(shù)對B579芽孢形成的關(guān)鍵基因進(jìn)行分析，獲得了含有綠色熒光蛋白基因和芽孢形成關(guān)鍵基因玈po0A的重組質(zhì)粒，以期為進(jìn)一步研究生防菌B579芽孢形成規(guī)律奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種及載體。供試菌種為枯草芽孢桿菌（獴acillus subtilis）B579，質(zhì)粒為pUC18和pGFP。

1.1.2 主要試劑。限制性內(nèi)切酶Xba I和EcoR I、pfu聚合酶、T4DNA連接酶、DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA marker，均由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供；膠回收試劑盒，由北京天恩澤基因科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成。根據(jù)NCBI報道的枯草芽孢桿菌獴acillus subtilis subsp.玸ubtilis str.168 玸po0A基因序列（Gene ID：938655），分析其啟動子P玸po0A，開始設(shè)計1對特異性擴(kuò)增引物，上游引物5端加有玐ba I酶切位點，下游引物5端加有獷co玆 I酶切位點：P玸po0A1：5睺GCTCTAGAGTTTCTTCCTCCCCAAATGTAGTTAACAGGA3，下劃線為玐ba I酶切位點；P玸po0A2：5睠CGGAATTCACTGCCGGAGTTTCCGGCAGT睺TTTTTATTTTGA3，下劃線為獷co玆 I酶切位點。引物交由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增。按DNA提取試劑盒說明書提取枯草芽孢桿菌的基因組DNA，以總基因組為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸15 s，共循環(huán)30個循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3

重組表達(dá)質(zhì)粒pGFP睵玸po0A的構(gòu)建。將純化后的PCR產(chǎn)物和載體pGFP78分別經(jīng)玐ba I和獷coR I雙酶切，膠回收目的基因片段和載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶16 ℃連接12 h，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGFP勃玃spo0A，利用電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行┳化。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌B579基因組DNA的提取 枯草芽孢桿菌B579（獴acillus Subtilis B579）基因組DNA質(zhì)量的好壞直接影響獲取玸po0A基因啟動子（P玸po0A）的質(zhì)量。因此，取3 ml枯草芽孢桿菌B579（進(jìn)入對數(shù)期）菌液進(jìn)行基因組DNA的提取，根據(jù)電泳圖1顯示，基因組DNA條帶單一，提取完整，并無降解，無雜質(zhì)，無拖尾，獲得了質(zhì)量較好的基因組DNA。

注：M：玊rans15K DNA Marker；1：The genomic DNA。

圖1 枯草芽孢桿菌B579基因組DNA

2.2 玸po0A序列分析 根據(jù)NCBI報道，玸po0A基因803 bp。將所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast，與GenBank已公布的枯草芽孢桿菌獴acillus subtilis168 玸po0A基因兩者相似性分別為97%。因此，說明B579中具有玸po0A基因（圖2）。

注：M：玊rans2K㏕M Plus DNA Marker；1：玸po0A基因 PCR 產(chǎn)物。

圖2 玸po0A基因PCR產(chǎn)物

2.3 玸po0A基因在發(fā)酵過程中表達(dá)量的分析 取發(fā)酵過程中6、8、10 h培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌，采用RT睵CR法檢測玸po0A基因在發(fā)酵不同時間的表達(dá)量。圖3、5表明，發(fā)酵過程中玸po0A基因的表達(dá)量是不同的，隨發(fā)酵過程時間增加，所檢測到的C璗逐漸增大，表征為玸po0A基因的表達(dá)量。通過對芽孢形成規(guī)律的研究，玈po0A磷酸化是芽孢形成最初始的信號。根據(jù)發(fā)酵過程活菌及芽孢計數(shù)，枯草芽孢桿菌在這個時期進(jìn)入到芽孢形成的初始階段，在此階段進(jìn)行芽孢形成的干預(yù)應(yīng)具有明顯效果。

圖4表明，玸po0A基因引物的特異性很好。在引物溶解曲線中只出現(xiàn)一個單獨的尖峰，說明引物特異性好，根據(jù)以上結(jié)果可知，在發(fā)酵過程6~10 h，玸po0A基因表達(dá)量與芽孢數(shù)量呈正相關(guān)。

圖3 RT睵CR檢測枯草芽孢桿菌玸po0A基因表達(dá)量

圖4 玸po0A基因引物溶解曲線

圖5 C璗值隨時間變化曲線

2.4 玸po0A基因啟動子的克隆 根據(jù)NCBI報道，玸po0A基因啟動子（P玸po0A）全長294 bp。以枯草芽孢桿菌B579的基因組DNA為模板，通過PCR，擴(kuò)增玸po0A基因啟動子。圖6表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亮度明顯，在300 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，其大小與玸po0A基因啟動子（P玸po0A）294 bp大小基本一致，說明PCR擴(kuò)增結(jié)果正確。

注：M：玊rans2K㏕M Plus DNA Marker；1：玸po0A基因啟動子 PCR ┎物。

圖6 玸po0A基因啟動子PCR產(chǎn)物

2.5 克隆載體的構(gòu)建 利用pfu聚合酶得到的玸po0A基因啟動子（玃spo0A）片段為平末端片段，純化后的片段直接與pGFP78平末端克隆載體連接。挑取單菌落培養(yǎng)，按照質(zhì)粒小提試劑盒步驟從單克隆菌液中提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證。鑒定正確的克隆載體，交由上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序。

圖7為重組克隆質(zhì)粒PCR驗證結(jié)果，圖7的第1泳道是以重組質(zhì)粒pGFP睵玸po0A為模板的PCR反應(yīng)，得到了一條大小在300 bp左右的條帶，大小與圖7中PCR產(chǎn)物大小結(jié)果相符。圖8為重組克隆質(zhì)粒pGFP睵玸po0A雙酶切驗證結(jié)果，圖中

注：M：玊rans Mark I DNA Marker；1：pGFP睵玸po0A PCR。

圖7 重組克隆質(zhì)粒pGFP睵玸po0A PCR驗證

注：M：玊rans2K㏕M II Plus DNA Marker；1：pGFP睵玸po0A / Eco玆 I /玐ba 獻(xiàn)。

圖8 重組克隆質(zhì)粒pGFP睵玸po0A雙酶切驗證

顯示從pGFP睵玸po0A上切下一條大小為300 bp左右的片段，大小與PCR結(jié)果相符，另一條4 800 bp左右大小的條帶與空質(zhì)粒大小一致，說明克隆載體pGFP睵玸po0A構(gòu)建┏曬?。?/p>

2.6 玸po0A 基因啟動子序列分析將所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast，與GenBank已公布的枯草芽孢桿菌獴acillus subtilis168 玸po0A基因啟動子兩者相似性為98%。

3 結(jié)論與討論

試驗以枯草芽孢桿菌B579基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到芽孢形成基因啟動子P玸po0A，其長度與NCBI上報道的玸po0A啟動子大小相同，均為294 bp。將P玸po0A連接到pGFP78上，構(gòu)建pGFP睵玸po0A重組質(zhì)粒。通過測序驗證質(zhì)粒構(gòu)建成功。此重組質(zhì)?？梢詾榭莶菅挎邨U菌快速檢測芽孢形成提供基礎(chǔ)。以枯草芽孢桿菌B579 RNA為模版，通過反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，RT睵CR檢測芽孢形成關(guān)鍵基因玸po0A的表達(dá)量，結(jié)果表明在發(fā)酵過程前期（6~10 h）中，隨發(fā)酵過程的進(jìn)行，玸po0A的表達(dá)量與芽孢數(shù)量呈正相關(guān)。該結(jié)論為進(jìn)一步研究提供了重要的理論依據(jù)。

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