尼秀媚 陳長法 封立平 吳興海 徐瓊

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266001；2.青島出入境檢驗檢疫局，山東青島 266001）お

摘要

對番茄斑萎病毒(TSWV)的生物學(xué)特性、分布、寄生范圍、危害癥狀、傳播途徑、檢測技術(shù)研究進展進行了綜述，并對今后的研究方向進行了展望。

關(guān)鍵詞 番茄斑萎病毒；危害；檢測技術(shù)

中圖分類號 SB436.412.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2014）19-06253-03

Research Progress of Tomato Spotted Wilt Virus

NI Xiu瞞ei et al

(Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao, Shandong 266001)

AbstractThe research advances of biological characteristics, distribution, parasitism range, damage symptoms, transmission route and detection technique of Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) were reviewed, the future research was forecasted.

Key words Tomato spotted wilt virus; Harm; Detection technique

基金項目 山東省科技攻關(guān)項目（2011GGB50003）。

作者簡介

尼秀媚（1979-），女，山東青島人，工程師，博士，從事植物病蟲害檢疫工作。

收稿日期 20140606

番茄斑萎病毒在大麗菊首次發(fā)現(xiàn)后，相繼從青椒、番茄及許多其他觀賞植物分離出該病毒。20 世紀90年代末番茄斑萎病毒迅速在世界多地傳播，成為對溫室中栽培的觀賞植物、蔬菜等侵襲最嚴重的病原之一［1］。番茄斑萎病毒屬于玊ospovirus屬,由薊馬傳播散布，屬于尼亞病毒科,具有廣泛寄主范圍,能感染超過82科900種植物［2］。由于該病毒的寄主廣泛性和危害巨大性，筆者對該病毒的分布、寄主、傳播途徑、檢測技術(shù)、轉(zhuǎn)基因育種方面研究進展進行了綜述，旨在為該病毒的防治與傳播控制提供理論依據(jù)。

1 生物學(xué)特性

病毒粒子呈球型，直徑約85 nm，表面包裹有1層膜，膜外層由突起層組成，突起層厚5 nm，幾乎連續(xù)。Tas等［3］用SDS睵AGE測定出4種蛋白，相對分子質(zhì)量分別為27×103、52×103、58×103和78×103，含有4種結(jié)構(gòu)蛋白，包括：糖蛋白G1，其分子質(zhì)量為78.0 kDa；糖蛋白G2，其分子質(zhì)量為58.0 kDa；蛋白L，分子質(zhì)量為200.0 kDa；外殼蛋白N，其分子質(zhì)量為28.8 kDa。粒子重量的20%～30%為脂類，粒子重量的7%為碳水化合物，病毒包裹3分子線形ssRNA，其基因組長約16 600 nt，核酸占病毒粒子總重量的1%～2%，各基因組RNA 均由核衣殼蛋白(N)包被,形成擬核衣殼結(jié)構(gòu),每一雙層膜結(jié)構(gòu)內(nèi)包被3個核衣殼。大的RNA 片段(L)為8 897 nt，編碼RNA聚合酶(331 kD)，小RNA片段(S,2 916 nt)和中等大小RNA 片段(M,4 821 nt)以反義方式排列,小RNA編碼核衣殼蛋白(30 kD)及非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)，mRNA的互補鏈編碼G1和G2的前蛋白和一種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)，病毒鏈編碼運動蛋白(M,33.6 kD)。粗汁液鈍化溫度為40～46 ℃（10 min），稀釋限點為2×10-3獈2×10-2，離體病毒的體外存活期為室溫下2～5 h［4］。

2 分布

番茄斑萎病毒最早發(fā)現(xiàn)于澳大利亞［5］，目前在全球多個氣候帶的國家和地區(qū)廣泛分布。早在20世紀30 年代，該病毒已被認為是農(nóng)作物的重要病毒病原。20世紀八九十年代，番茄斑萎病毒在美國夏威夷、意大利、南非和巴西的流行曾導(dǎo)致番茄、萵苣等作物近乎絕產(chǎn)。在美國夏威夷、巴西和南非，由于番茄斑萎病毒較高的發(fā)生率致使農(nóng)民放棄生產(chǎn)。在有些年份，夏威夷萵苣作物受番茄斑萎病毒破壞損失達50%～90%［2］。由于媒介西花薊馬的發(fā)生和擴展，番茄斑萎病毒在多個國家的番茄、銀蓮花和辣椒中出現(xiàn)破壞性暴發(fā)，并在歐洲多個國家的煙草上出現(xiàn)毀滅性流行病害。番茄斑萎病毒也是美國花生生產(chǎn)的嚴重病害。番茄斑萎病毒是最重要的農(nóng)作物和觀賞植物病毒之一，雜草被該病毒侵染時可能成為其越冬寄主，同時為其傳播提供初侵染源。

3 寄主范圍和危害癥狀

番茄斑萎病毒的寄主范圍廣泛，包括30多科雙子葉植物和7科單子葉植物的100多種植物可自然感病，汁液接種可傳播50多科300多種植物。茄科、葫蘆科、菊科和豆科植物都受害嚴重。其重要的寄主植物很多，主要經(jīng)濟作物有煙草、馬鈴薯、番茄、茄、花生、辣椒等。該病毒同時可感染一些常見的雜草，如三葉鬼針草、蒲公英等；系統(tǒng)侵染的寄主有番茄、百日草、煙草和萵苣等；局部侵染的寄主有矮牽牛、心葉煙及黃瓜等［6］。據(jù)報道，該病毒能引起嚴重的經(jīng)濟損失，

番茄斑萎病毒侵染70科900多種植物，包括糧食、煙草、蔬菜及花卉，因此受到國際植物病理學(xué)界的重視［7］。既使是在同一寄主植物上,因品種、年齡、營養(yǎng)狀況和環(huán)境條件的不同，番茄斑萎病毒的危害癥狀也會有很大差異。下面對該病毒在一些觀賞植物和重要經(jīng)濟作物上產(chǎn)生的癥狀進行描述。

3.1 煙草上的癥狀

番茄斑萎病毒為系統(tǒng)侵染整株發(fā)病。病害癥狀隨植株大小、病毒株系、環(huán)境條件及煙草品種的不同而不同［3］。該病毒在幼嫩葉片上引起壞死斑點、斑紋或同心輪紋，有時在葉片上可密布小壞死環(huán)，這些環(huán)經(jīng)常合并為大斑，形成不規(guī)則壞死區(qū)。該病毒與其他壞死病毒病的顯著特征差異在于：煙草病株矮化，頂芽萎蔫下垂或向下彎曲，或葉片扭曲，生長不對稱。植株感染嚴重時數(shù)周不長，葉片萎蔫下垂，最終死亡。染病葉片出現(xiàn)扭曲、皺折或萎蔫癥狀，失去烘烤價值［8］。

3.2 鳳仙花上的癥狀

受番茄斑萎病毒感染的鳳仙花出現(xiàn)矮化現(xiàn)象，葉片上有褐色葉斑或葉基變?yōu)楹谏?/p>

3.3 番茄上的癥狀

染病時幼葉產(chǎn)生小的黑褐色病斑,染病植株的葉片褪綠，變?yōu)槊鼽S色,莖部和葉柄出現(xiàn)暗褐色條紋。染病果實的典型癥狀表現(xiàn)為：果皮產(chǎn)生白色至黃色同心環(huán)紋,環(huán)中心突起導(dǎo)致果面不平。該病毒病的重要診斷特征是在紅色成熟果實上有非常明顯的明亮黃色環(huán)紋。

3.4 花生上的癥狀

花生發(fā)病具加重趨勢，花生的發(fā)病率在某些地區(qū)達90%以上，主要癥狀為褪綠斑、頂芽壞死等。癥狀因番茄斑萎病毒分離株的不同而不完全相同,葉片褪綠，芽壞死和植株死亡是典型癥狀。

3.5 萵苣上的癥狀

病株發(fā)病由一側(cè)葉片開始，葉片發(fā)病時產(chǎn)生褪綠并出現(xiàn)褐色斑塊,隨后中央葉片褪色,最終該側(cè)植株停止生長，產(chǎn)生特征性變形。

4 番茄斑萎病毒傳播途徑

4.1 病毒傳播介體種類和傳播特性

玊ospovirus屬病毒的傳播介體為薊馬，世界上薊馬超過5 000種，但只有不到0.2%的薊馬能夠傳播番茄斑萎病毒［9］。目前文獻報道可傳播該病毒的薊馬有12種，分別是西花薊馬（Frankliniella occidentalis）、番茄薊馬（F．schultzei）、褐花薊馬（F．fusca）、禾花薊馬（F．tenuicornis）、臺灣花薊馬（F．intonsa）、佛羅里達花薊馬（F．bispinosa）、首花薊馬（F．cephalica）、煙薊馬（Thrips tabaci）、豆薊馬（T．setosus）、T．palmi、T．moultoni、Scirtothrips dorsalis和F．tenuicornis，但目前經(jīng)過多人證實，認為能有效傳播番茄斑萎病毒的薊馬種類為上述12種中的前8 種［10］，其中西方花薊馬是最主要的傳播媒介［11］。オ

西花薊馬在25 ℃條件下可存活12 d。在多數(shù)情況下,其繁殖高峰期在夏天,但在35 ℃以上的高溫條件下繁殖停止。在-5 ℃以下的試驗條件下,西花薊馬能存活30 d。大田試驗條件下，在美國東南部地區(qū)西花薊馬能在大田里越冬,并繼續(xù)繁殖。

番茄斑萎病毒以循環(huán)增殖型傳播方式傳播，傳播介體一旦攜帶病毒，則終生帶毒。該病毒能在介體昆蟲體內(nèi)以自行復(fù)制的方式提高其傳播效率［12］。

西花薊馬的卵、若蟲、蛹和成蟲4 個發(fā)育階段中，只有若蟲和成蟲階段才能傳毒。西花薊馬若蟲取食感病植株時感染病毒，若蟲和成蟲攜帶病毒轉(zhuǎn)移取食，可在寄主植物之間傳毒［12］。但西花薊馬獲毒只可在若蟲階段，成蟲階段不能獲毒。若蟲通常需要在染病植株上取食15～30 min或者以上時間才能有效獲毒；若蟲獲取該病毒后，無法立即傳播，通常需要在西花薊馬體內(nèi)復(fù)制增殖72 h以上才能有效傳播,攜毒西花薊馬的傳毒能力可保持22～30 d，但不會經(jīng)卵傳到后代［13］。

4.2 薊馬傳毒機制

西方花薊馬若蟲取食寄主植物并破壞植物組織后，感染病毒的寄主植物中的病毒粒子首先跟隨植物組織汁液進入薊馬若蟲口腔，然后到達中腸并侵染中腸，番茄斑萎病毒表面的糖蛋白可保護病毒穿過中腸圍食膜［14-15］。研究還發(fā)現(xiàn)，該病毒在侵染薊馬過程中，病毒外鞘膜糖蛋白必不可少，其進入西方花薊馬中腸之后，與中腸上皮細胞膜上的受體蛋白結(jié)合，到達中腸上皮組織。Whitfield 等［16］研究證實病毒包膜糖蛋白GN睸能降低薊馬對斑萎病毒的轉(zhuǎn)移傳遞，由于病毒自身小RNA編碼的非結(jié)構(gòu)性(NSs)蛋白和核衣殼(N)蛋白的作用，使得病毒可以順利復(fù)制。

5 番茄斑萎病毒檢測技術(shù)

田間檢驗的標準方法是通過觀察病害癥狀表現(xiàn),但有時植株帶病毒而不表現(xiàn)癥狀。采用ELISA法可從無癥狀植株葉片和根部檢測出番茄斑萎病毒。目前,已有多種血清學(xué)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)應(yīng)用于植物上番茄斑萎病毒的檢測［15，17-19］。在田間病害監(jiān)測過程中,通常需要確定介體薊馬的帶毒狀況,在病害流行早期,監(jiān)測帶毒介體薊馬將有利于該病毒病的控制,但因薊馬個體較小,對單頭蟲體內(nèi)病毒的檢測較困難,許多研究者采用ELISA檢測薊馬體內(nèi)的番茄斑萎病毒［20］。但Fukuta等［21］發(fā)現(xiàn)薊馬傳毒能力和病毒檢測結(jié)果間相關(guān)性較小，采用LAMP、IC/RT睵CR檢測菊花植株中的番茄斑萎病,其靈敏度比常規(guī)的IC/RT睵CR靈敏度高100倍左右。

為建立可靠、快速和簡便的檢測單頭薊馬的番茄斑萎病毒方法,近些年有研究者對檢測技術(shù)進行了改進。Masona等［22］采用RT睵CR 檢測到薊馬體內(nèi)的番茄斑萎病；Boonham 等［23］報道了一種靈敏、高通量的檢測單個薊馬中番茄斑萎病毒的TaqMan實時熒光RT睵CR技術(shù)。此外,還可通過汁液摩擦接種草本鑒別寄主進行檢測,常用的鑒別寄主植物有黃瓜、本氏煙、矮牽牛、心葉煙、克利夫蘭、長春花、普通煙等。但因許多其他病毒也可侵染上述植物并表現(xiàn)相似癥狀,對表現(xiàn)癥狀的植株還需采用血清學(xué)和PCR等技術(shù)進一步確認病毒種類。

6 討論

斑萎病毒屬病毒是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的植物病毒之一，在自然條件下能侵染辣椒、番茄等多種作物，嚴重損失產(chǎn)量。目前，對該屬病毒的鑒定和檢測方法主要有電鏡觀察、生物接種、分子生物學(xué)檢測、血清學(xué)技術(shù)等［24］。關(guān)于西花薊馬獲毒和傳毒方式、西花薊馬傳播病毒的機理、該病毒對西花薊馬和寄主植物作用的研究，國外都取得很大進展，但番茄斑萎病 在西花薊馬體內(nèi)存在方式、病毒包膜糖蛋白GN睸、核衣殼(N)蛋白以及非結(jié)構(gòu)性(NSs)蛋白等作用的機理還有待進一步研究［25］。近年來，番茄斑萎抗病毒的育種研究發(fā)展迅速，在上述多種方法中，以病毒來源基因介導(dǎo)的抗性所取得成就最大,但可能會引起生物安全性問題。植物玆基因介導(dǎo)的抗性會隨著病菌群體的變化很快喪失,因此只有發(fā)現(xiàn)和克隆新的具有廣譜抗性和持久抗性的玆基因,才能在番茄抗病毒上發(fā)揮更有效的作用。

番茄斑萎病毒病對番茄的影響最大，目前雖然是我國進境禁止攜帶的有害生物之一，但在一些省份已經(jīng)發(fā)生，且有加重趨勢。如在我國的云南地區(qū)，番茄斑萎病毒已經(jīng)是番茄生產(chǎn)上的頭號殺手，對農(nóng)民造成巨大損失。山東是蔬菜種植大省，茄科作物種植面積十幾萬畝，番茄的種植面積又占總種植面積的1/3以上，而番茄斑萎病毒的傳播介體西花薊馬在山東已經(jīng)暴發(fā)，因此，防止番茄斑萎病毒病侵染番茄，及時發(fā)現(xiàn)并及時防治任務(wù)緊迫。

目前山東省出入境檢驗檢疫局在山東番茄上發(fā)現(xiàn)疑似番茄斑萎病毒的病株，并采集20余份標本，經(jīng)鑒定不是番茄斑萎病毒，大部分是ToMV，有的樣品沒有定論，分析原因可能是由于在RNA提取過程中造成RNA降解，也可能是在轉(zhuǎn)錄操作過程中出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄不成功的情況，還可能標本所攜帶的病毒種類不同，有些標本所感染的病毒為還沒有開展或者沒有進行檢測的病毒，因此造成結(jié)果不確定的情況。但在番茄上未檢測到斑萎病毒，說明番茄斑萎病毒目前在番茄上還未發(fā)生。但在采集的10份辣椒標本上檢測到疑似該病毒病的發(fā)生，具體是否為斑萎病毒，還需利用平行的分子方法及接種試驗進行進一步鑒定。通過調(diào)查結(jié)果說明山東蔬菜保護地番茄斑萎病毒的發(fā)生存在高風(fēng)險，需植保等相關(guān)農(nóng)業(yè)部門高度重視，加強該病的排查與風(fēng)險評估，防止在山東發(fā)生和蔓延。

番茄斑萎病毒病之所以危害嚴重，是因為該病毒特殊的生物學(xué)習(xí)性，能夠造成該病毒大暴發(fā)的重要習(xí)性是該病毒的越冬特性及傳播特性。番茄斑萎病毒能夠依靠野生品種例如多種雜草進行越冬，而雜草的主要生物學(xué)特性是繁殖力強，難于根除，造成該病毒越冬寄主豐富，不會因為寒冷的冬季而降低侵染數(shù)量，保證了來年的侵染源。同時該病毒的傳播介體是多種薊馬，薊馬的生物學(xué)特點是數(shù)量大、繁殖速度快、難于防治、遷飛能力強，而且一旦獲毒終生帶毒，給該病毒的傳播提供了良好的介體。同時由于薊馬的活動性，致使該病毒傳播距離及傳播速度大幅上升，因此易造成短時間內(nèi)大暴發(fā)。

目前番茄斑萎病毒的防治還處于初級階段，植物病毒病猶如動物的惡性腫瘤，抗病品種是最好的防治辦法，就像動物的惡性疾病，預(yù)防接種是最好的防治方法，但抗番茄斑萎病毒病抗病品種較稀缺，而且番茄斑萎病毒病侵染寄主種類繁多，對抗病育種提出了嚴峻考驗。目前主要使用的抗病品種還是抗花葉病毒的品種，因此抗病育種迫在眉睫。然而抗病育種目前也遇到問題，一方面抗病育種周期長，耗費人力物力大，另一方面病毒變異速度快，可能1個抗病品種栽培幾年就會被突變的小種侵染，因此采用多種措施綜合防治是防治病毒暴發(fā)的最合理的措施。目前，采用綜合管理措施也是防止該病暴發(fā)的主要措施，如清除越冬寄主、拔出病株病焚燒、撲殺傳毒薊馬、早期用藥等。

番茄斑萎病毒每年造成的損失根本無法統(tǒng)計，因為作物一旦感染又不能及時防治就會造成絕產(chǎn)，因此目前世界范圍內(nèi)的農(nóng)業(yè)部門與科學(xué)家都在進行該病毒的相關(guān)生物學(xué)、防控措施的研究，我國作為番茄斑萎病毒的非疫區(qū)（僅在部分地區(qū)發(fā)生），應(yīng)提高警惕，防止該病的大規(guī)模入侵與暴發(fā)。

防止番茄斑萎病毒病的暴發(fā)前期苗木的無毒控制非常關(guān)鍵，現(xiàn)有的檢測技術(shù)靈敏度逐漸提高，如HPLC技術(shù)等，因此進行番茄各個生長周期的無毒控制對于該病的防治具有重要意義。

目前侵染番茄的病毒病種類繁多，大概有20余種，但其中為害大、分布廣、損失嚴重、難以防控的種類主要有各種花葉病毒（TMV、ToMV）、煙草卷葉病毒、苜?；ㄈ~病毒、雙生病毒病、番茄斑萎病毒等。其中番茄雙生病毒病已經(jīng)在山東暴發(fā)，如蔬菜種植大縣萊西市、壽光市，對番茄的生產(chǎn)造成巨大危害，也造成重大經(jīng)濟損失。各種花葉病毒病雖然發(fā)生較普遍，但目前防控措施與體系較完備，加上抗病品種的應(yīng)用，因此目前損失是可控的。番茄斑萎病毒作為一種新型入侵病害，一旦發(fā)生，造成的損失比目前已經(jīng)發(fā)生的病毒病都要嚴重，因此防控番茄斑萎病毒病的發(fā)生要作為農(nóng)業(yè)部門及植保部門的重要長期任務(wù)，同時相關(guān)檢疫部門也應(yīng)加強檢疫，因為我國目前蔬菜種質(zhì)資源90%依靠進口，因此把好國門關(guān)也是防止該病發(fā)生蔓延的重要舉措。只要相關(guān)部門高度重視，同時對農(nóng)民進行基本培訓(xùn)，就可達到較好的防控效果。

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