梁昌聰 劉磊 張建華 郭立佳 王偉偉 黃俊生

摘 要 采用響應(yīng)面法對(duì)綠色木霉H06菌株產(chǎn)孢發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。首先利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響產(chǎn)孢的 3個(gè)主要因素： 玉米粉、大豆粕和 KH2PO4。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用最陡爬坡路徑法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，最后利用響應(yīng)面分析法確定主要因子之間的交互作用及最佳條件。結(jié)果表明，蔗糖10 g/L、玉米粉12.75 g/L、NH4NO3 2 g/L、大豆粕4.65 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO4 3.32 g/L、H06最大理論孢子含量為3.29×109個(gè)/mL。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際平均孢子含量與預(yù)測(cè)孢子含量相近，比之前的孢子含量提高了197%。

關(guān)鍵詞 響應(yīng)面法；綠色木霉；產(chǎn)孢；優(yōu)化

中圖分類號(hào) S216.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的一種毀滅性的土傳病害，已嚴(yán)重危害到香蕉的生產(chǎn)及香蕉產(chǎn)業(yè)[1]。目前綜合防控技術(shù)是香蕉枯萎病防治的主要手段，木霉（Trichoderma spp.）作為一種重要的植病生防菌一直受到普遍關(guān)注。綠色木霉菌（Trichoderma viride）廣泛地分布于自然界，可在多種營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)上快速生長(zhǎng)， 對(duì)多種植物病原菌有重寄生作用，能有效地競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和生存空間，還可以產(chǎn)生抗生素和攻擊多種病原所需要的酶，所以被認(rèn)為是一種很有開發(fā)潛力的生防菌[2]。

綠色木霉菌H06（T. viride）是中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所微生物資源研究與利用課題組從香蕉根際土壤中分離獲得的拮抗鐮刀菌的菌株，對(duì)香蕉枯萎病等植物病害有明顯的防治效果[3]，應(yīng)用前景廣闊。

響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，RSM），包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)、建立模型、分析模型合理性和尋求最優(yōu)解等眾多試驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)技術(shù)。響應(yīng)面分析法是降低開發(fā)成本、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件、提高生產(chǎn)效率、解決生產(chǎn)實(shí)際問題的更為有效的方法[4-7]。 該法在生物發(fā)酵方面已有廣泛應(yīng)用[7-9]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于綠色木霉產(chǎn)孢優(yōu)化的研究方法比較單一，主要為單因素法和正交法。如肖龍龍等[10]用單因素法確定了綠色木霉產(chǎn)孢的最優(yōu)條件，劉時(shí)輪等[11]用單因素法和正交法確定了綠色木霉菌株Tv04-2固體最優(yōu)發(fā)酵條件。但是對(duì)綠色木霉液體產(chǎn)孢研究很少并且將響應(yīng)面分析法應(yīng)用到綠色木霉液體產(chǎn)孢發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化目前未有報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用Minitab16軟件中的Plackett-Burman設(shè)計(jì)法[12]、最陡爬坡路徑法[13]和響應(yīng)面分析法（RSM）中的Box-Behnken設(shè)計(jì)[14]相結(jié)合對(duì)綠色木霉產(chǎn)孢進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，提高發(fā)酵液中孢子含量， 為綠色木霉發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 綠色木霉菌H06，從香蕉根際土壤中分離獲得，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：蔗糖20 g、NH4NO3 4 g、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO4 2 g、水1 000 mL。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10 g、玉米粉10 g、NH4NO3 2 g、大豆粕5 g、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO4 2 g、水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 （1）種子液制備：取 28 ℃ 下培養(yǎng)成熟的斜面試管1支，用無(wú)菌生理鹽水沖洗，適當(dāng)稀釋，配制成108個(gè)/mL 的孢子懸浮液，以 10%的接種量接入裝有100 mL 種子液的 250 mL三角瓶中，28 ℃ 、180 r /min 下培養(yǎng) 48 h。

（2）搖瓶培養(yǎng)條件：初始發(fā)酵培養(yǎng)基 250 mL 搖瓶裝液量 100 mL，以 5%的接種量接種，28 ℃、180 r/min下培養(yǎng) 72 h。

（3）孢子含量測(cè)定：用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) （1）Plackett-Burman設(shè)計(jì)法篩選影響發(fā)酵液孢子含量的顯著性影響因素：Plackett-Burman設(shè)計(jì)法是一種近飽和的2水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。它基于非完全平衡塊原理，能用最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng)，從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素以供進(jìn)一步研究[15]。將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的6個(gè)組分作為影響因素進(jìn)行全面考察，選擇9因子及實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以C、E、I作為空項(xiàng)以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，以A、B、D、E、G、H分別代表蔗糖，玉米粉，NH4NO3，大豆粕，MgSO4·7H2O，KH2PO4，每個(gè)因素取高低2個(gè)水平（表1）。

（2）最陡爬坡路徑方法確定重要因子的最適濃度范圍：響應(yīng)面只有在臨近最佳值時(shí)才能建立有效的響應(yīng)面方程。最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域[16]。根據(jù)（1）Plackett-Burman設(shè)計(jì)法實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，做最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

（3）響應(yīng)面分析法確定最佳培養(yǎng)基配方：以爬坡設(shè)計(jì)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，用軟件 Minitab16對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析并且進(jìn)行誤差分析并求得最優(yōu)值，得出響應(yīng)面分析結(jié)果，進(jìn)而確定最佳培養(yǎng)條件，最后依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖。

（4）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：用所得到的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，以驗(yàn)證模型是否可靠，進(jìn)而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2，分析結(jié)果見表3。表3的P值大小可以看出，對(duì)綠色木霉H06初始培養(yǎng)基中的孢子含量具有顯著影響的因子依次是H>E>B，即KH2PO4>大豆粕>玉米粉，確定這3個(gè)因素作為下一步實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表 3 中 B、E、H 3 個(gè)因素估計(jì)系數(shù)的正負(fù)效應(yīng)，依次增大或減小，KH2PO4、玉米粉是正效應(yīng)，應(yīng)依次增大；大豆粕是負(fù)效應(yīng)，應(yīng)依次減小。爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，隨著玉米粉、KH2PO4濃度逐漸增大，大豆粕濃度逐漸減小，H06孢子含量呈現(xiàn)先增大后減小的變化。當(dāng)玉米粉為13 g/L，大豆粕為 4.5 g/L，KH2PO4為3.5 g/L 時(shí)，孢子含量達(dá)到最大，為3因子的最大響應(yīng)值區(qū)域。因此以表4中實(shí)驗(yàn)號(hào)4各因素水平為中心值設(shè)計(jì)后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

3個(gè)重要因子的最適合濃度范圍確定后，以玉米粉13 g/L，大豆粕4.5 g/L，KH2PO4 3.5 g/L為中心點(diǎn)實(shí)施響應(yīng)面分析，各自變量水平見表5， Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表6和表7。該二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2=0.965 5，表明僅有 3.45%的變異不能由此模型解釋； 回歸模型p值（ prob>F）=0.004 表明模型是顯著的，失擬項(xiàng)p值為0.264，表明失擬不顯著，模型沒有失擬現(xiàn)象。模型的線性、平方的影響是顯著的，交互作用影響不顯著。經(jīng)回歸擬合后，得到二次多項(xiàng)式方程：

Y=-60.723 7+8.265 42X1+3.04X2+2.505 83X3-0.309 58X1X1-0.328 333X2X2-0.218 333X3X3-0.01X1X2-0.095X1X3+0.04X2X3

根據(jù)上述擬合回歸方程做出響應(yīng)面分析圖，見圖1～圖3。圖1中當(dāng)固定KH2PO4 3.32 g/ L時(shí)，玉米粉從 12 g/L 增大至 14 g/L，大豆粕從 4 g/L 增大至5 g/L 的過(guò)程中，發(fā)酵液孢子含量均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，曲面的頂點(diǎn)即為孢子含量最大值點(diǎn)。同理，圖2和圖3中的曲面分別反映了玉米粉和KH2PO4、大豆粕和KH2PO4的交互作用。

2.4 模型驗(yàn)證

由模型可得玉米粉12.75 g/L，大豆粕為4.65 g/L，KH2PO4為3.32 g/L時(shí)，預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)值為3.29×109個(gè)/mL。為證實(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果， 在該濃度下進(jìn)行重復(fù)搖瓶實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果分別為3.26×109、3.33×109、 3.24×109個(gè)/mL，平均值為（3.28±0.05）×109個(gè)/mL與預(yù)測(cè)值3.29×109個(gè)/mL接近，二者的良好擬合性證實(shí)了模型的有效性。優(yōu)化后得到綠色木霉菌H06菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：蔗糖10 g/L、玉米粉12.75 g/L、NH4NO3 2 g/L、大豆粕4.65 g/L、MgSO4 1 g/L、KH2PO4 3.32 g/L。

3 討論與結(jié)論

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的常用方法有單因素法和正交法。單因素法只針對(duì)某一因素的影響，不考慮發(fā)酵培養(yǎng)基多種組分間的交互作用，難以取得發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的最佳結(jié)果[17]。正交法只能得到最佳因素水平的組合，同時(shí)也考慮發(fā)酵培養(yǎng)基的多種因素間的交互作用；但在正交法中，當(dāng)考慮因素之間的交互作用時(shí)，正交試驗(yàn)次數(shù)會(huì)大大增加，另外正交法在最后選取最佳實(shí)驗(yàn)方案時(shí)，對(duì)于不顯著因素的選取一般是憑經(jīng)驗(yàn)[17]。響應(yīng)面分析法是 1951年Box- Wilson開發(fā)的用于化學(xué)過(guò)程因子優(yōu)化的一種綜合性方法，用于研究多因子系統(tǒng)中因子交互作用達(dá)到最大響應(yīng)值時(shí)所對(duì)應(yīng)的最佳條件[17]。國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者通過(guò)響應(yīng)面分析法在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方面取得了良好效果[10-12， 15-16]。

本研究通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)，快速有效地從6個(gè)影響綠色木霉菌產(chǎn)孢子的因素中篩選出3個(gè)顯著性影響因素： 玉米粉、大豆粕和KH2PO4，然后利用最陡爬坡法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域并用 Box-Behnken設(shè)計(jì)得出最佳培養(yǎng)基組合： 蔗糖10 g/L、玉米粉12.75 g/L、NH4NO3 2 g/L、大豆粕4.65 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO4 3.32 g/L。在最佳培養(yǎng)基組合下，綠色木霉菌H06實(shí)際孢子含量達(dá)到3.28×109個(gè)/mL，與理論最大孢子含量3.29×109個(gè)/mL接近，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化綠色木霉菌H06液體發(fā)酵孢子含量是合理可靠的。經(jīng)優(yōu)化，孢子含量比優(yōu)化前提高了197%。

由于目前綠色木霉菌常用于發(fā)酵制備各種酶[18-20]， 國(guó)內(nèi)對(duì)該菌的固體產(chǎn)孢發(fā)酵研究較多[10-11]，而關(guān)于該菌的液體產(chǎn)孢特性的研究較少[21]， 因此本研究的結(jié)果對(duì)于綠色木霉菌在發(fā)酵上有重要意義。

對(duì)于綠色木霉菌H06的發(fā)酵條件如溫度、pH、接菌量等是下一步的工作，在發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件確定后，進(jìn)行100、1 000 L等發(fā)酵罐的逐級(jí)放大，以優(yōu)化確定綠色木霉菌的液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝。

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