劉玉華等

摘要[目的] 為有效控制鴨大腸桿菌病的流行提供參考依據(jù)。[方法] 利用分離自泰州某規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)的大腸桿菌菌株TZY1作為菌種，制備鴨大腸桿菌鋁膠滅活苗，并進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)。[結(jié)果] 通過無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)和動(dòng)物保護(hù)力試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自制疫苗無外源性微生物污染，對(duì)雛鴨安全性好。對(duì)雛鴨的攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明制備疫苗的免疫保護(hù)率達(dá)100%，該疫苗的免疫劑量為0.5 ml。田間試驗(yàn)結(jié)果表明免疫保護(hù)率達(dá)95.1%。[結(jié)論] 成功制備了鴨大腸桿菌鋁膠滅活苗。

關(guān)鍵詞鴨；大腸桿菌；鋁膠；滅活苗；制備

中圖分類號(hào)S834文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）36-12929-02

Abstract[Objective] The research aimed to provide reference basis for controlling the prevalence of duck colibacillosis effectively. [Method] TZY1 strain of Escherichia coli separated from a largescale duck farm in Taizhou was used to prepare the aluminum hydroxide inactivated vaccine against Escherichia coli of duck. And its quality indices were examined. [Result] The results of sterilization test， safety examination and animal protection test showed that the selfprepared vaccine wasnt polluted by exogenous microorganisms and it had good safety to ducklings. The results of challenge experiment on ducklings showed that the immune protection rate of the selfprepared vaccine reached 100% and its immunization dose was 0.5 ml. The results of field experiment shoed that the immune protection rate was 95.1%. [Conclusion] Aluminum hydroxide inactivated vaccine against Escherichia coli of duck was successfully prepared.

Key wordsDuck； Escherichia coli； Aluminum hydroxide； Inactivated vaccine； Preparation

鴨大腸桿菌病是由某些致病血清型的大腸桿菌引起的鴨較為常見的細(xì)菌性疾病[1]。隨著泰州地區(qū)養(yǎng)鴨業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，鴨大腸桿菌病發(fā)病嚴(yán)重，死亡率高，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在養(yǎng)鴨生產(chǎn)中，使用抗菌藥物是治療鴨大腸桿菌病的主要方法，但由于大腸桿菌容易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致該病的藥物治療效果并不理想。接種疫苗是控制傳染病的有效措施之一，但我國(guó)目前已報(bào)道的鴨源致病性大腸桿菌血清型約有50余種，不同地區(qū)有一定差異[2]，市場(chǎng)上很難買到有效疫苗來預(yù)防鴨大腸桿菌病。筆者利用分離自泰州發(fā)病鴨場(chǎng)的大腸桿菌菌株研制鴨大腸桿菌自家鋁膠滅活苗，并進(jìn)行了相應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)，以期為有效控制鴨大腸桿菌病的流行提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。

制苗用菌株和攻毒用菌株均為致病性鴨大腸桿菌TZY1，由泰州某規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)大腸桿菌發(fā)病鴨的肝臟中分離、鑒定并保存。

1.1.2試劑。

普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG）、酪胨瓊脂（GA）、葡萄糖蛋白胨湯（GP）、麥?zhǔn)媳葷峁?、甲醛溶液、三氯化鋁、氫氧化鈉等。

1.1.3儀器。

高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)箱、電子天平、精密試紙、凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、冰箱等。

1.1.4試驗(yàn)動(dòng)物。5日齡未接種大腸桿菌病疫苗的健康雛鴨與19日齡未接種大腸桿菌病疫苗的健康鴨，均由泰州某規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)提供。

1.2方法

1.2.1氫氧化鋁膠（簡(jiǎn)稱鋁膠）的制備。

配制4%氫氧化鈉溶液和8%三氯化鋁溶液，向8%三氯化鋁溶液中緩慢加入4%氫氧化鈉溶液，邊攪拌邊加入，二者用量比約為1∶1，pH為5.6～6.0，反應(yīng)體系中的絮狀沉淀突然變成均一的乳白色狀態(tài)，即為終點(diǎn)，繼續(xù)攪拌10 min，121 ℃下高壓滅菌30 min。

1.2.2菌種毒力的測(cè)定。

將36只19日齡健康鴨隨機(jī)分成6組，每組6只。1～5組鴨分別肌肉接種致病性大腸桿菌菌株TZY1的肉湯培養(yǎng)物，菌液濃度為2.5×105 CUF/ml，1～5組劑量依次為0.2、0.4、0.6、0.8、1. 0 ml，第6組為對(duì)照組，肌肉接種1 ml的無菌生理鹽水，觀察1周后記錄各組鴨發(fā)病、死亡情況，觀察病變情況。

1.2.3疫苗制備。

將大腸桿菌菌種劃線接種于麥康凱瓊脂平板上， 37 ℃下培養(yǎng)18 h，挑取粉紅色、圓形隆起、表面光滑、邊緣整齊的菌落接種普通肉湯培養(yǎng)基中， 37 ℃下培養(yǎng)18 h，按照《獸藥典》方法進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)[3]，合格后即為種子液。按照培養(yǎng)基總量的2%將種子液接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃下振蕩培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)菌液用麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，調(diào)整菌液濃度為2×1010 CFU/ml。按照菌液總量的04%加入37%甲醛溶液，37 ℃滅活48 h，在此期間振蕩數(shù)次。然后，再向滅活菌液中加入20%鋁膠佐劑，充分混勻，分裝入滅菌的玻璃瓶?jī)?nèi)，即制成鴨大腸桿菌自家鋁膠滅活苗。

1.2.4質(zhì)量檢驗(yàn)。

1.2.4.1無菌檢驗(yàn)。

取滅活苗l ml接種于50 ml TG培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)3 d后，吸取上述培養(yǎng)物分別接種TG小管和GA斜面各2支， 0.2 ml/支，1支置于37 ℃條件下，另1支置于25 ℃條件下，另吸取0.2 ml接種1支GP小管，置于25 ℃條件下，均培養(yǎng)7 d，應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.2.4.2安全檢驗(yàn)。

5日齡健康雛鴨6只，各肌肉注射疫苗1 ml，觀察10 d，應(yīng)全部健活。

1.2.4.3動(dòng)物保護(hù)力試驗(yàn)。

5日齡健康雛鴨13只隨機(jī)分成3組：第1組5只鴨各肌肉注射疫苗0.5 ml，第2組5只鴨各肌肉注射疫苗0.2 ml， 第3組3只鴨作為對(duì)照組，不接種。接種14 d后，每只鴨各肌肉注射1 MLD的大腸桿菌TZY1株肉湯培養(yǎng)物，觀察14 d后記錄發(fā)病及死亡情況，剖檢病死鴨，觀察病變病況。

1.2.5田間試驗(yàn)。

從泰州某規(guī)?；唸?chǎng)分離的大腸桿菌菌株制成的疫苗，給該鴨場(chǎng)5日齡健康雛鴨肌肉接種， 0.5 ml/只，觀察應(yīng)用效果。

2結(jié)果與分析

2.1鋁膠制備

制備的鋁膠為淡灰白色、無臭、細(xì)膩的膠體，薄層半透明，靜置能析出少量水分，不含有異物，表明制備的鋁膠質(zhì)量?jī)?yōu)良，可以作為佐劑使用。

2.2毒力測(cè)定結(jié)果

能使80%～100%的攻毒鴨死亡或發(fā)?。üザ?周內(nèi)出現(xiàn)精神沉郁、排黃白、黃綠稀糞或有神經(jīng)癥狀，能從病鴨肝臟或心血中分離到接種菌）的最小攻毒菌量即為該日齡免疫鴨的攻毒菌量[4]。19日齡鴨攻毒后死亡率為100%時(shí)，大腸桿菌最小攻毒菌量為0.6 ml/只。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定大腸桿菌攻毒劑量為0.6 ml/只。

2.3疫苗制備結(jié)果

制備的鴨大腸桿菌自家鋁膠滅活苗靜置后，上層為微黃色澄明液體，下層為灰白色沉淀，振搖后呈均勻混懸液。

2.4質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果

2.4.1無菌檢驗(yàn)結(jié)果。

滅活苗接種于2支TG小管、2支GA斜面、1支GP小管中培養(yǎng)，觀察7 d后5支小管中均無任何細(xì)菌生長(zhǎng)，表明無菌檢驗(yàn)合格。

2.4.2安全檢驗(yàn)結(jié)果。

接種疫苗后10 d，6只雛鴨全部健活，注射疫苗局部無腫塊等嚴(yán)重不良反應(yīng)，精神、食欲未出現(xiàn)異常，表明制備的疫苗安全可靠。

2.4.3動(dòng)物保護(hù)力。

由表1可知，第3組3只雛鴨，攻毒后發(fā)病率和死亡率均為100%，剖檢病死鴨，發(fā)現(xiàn)心包炎、肝周炎、氣囊炎等大腸桿菌的病變特征，從肝臟中均分離到大腸桿菌，表明對(duì)照組結(jié)果正確，可以對(duì)第1組、第2組進(jìn)行結(jié)果判定。由表1可知，第1組雛鴨接種疫苗0.5 ml攻毒后發(fā)病率為0，死亡率為0；第2組中雛鴨接種疫苗0.2 ml攻毒后發(fā)病率為60%，死亡率為40%，表明鴨大腸桿菌自家鋁膠滅活苗接種劑量為0.5 ml時(shí)，免疫保護(hù)效果最好，可達(dá)100%，因此確定該疫苗的接種劑量為0.5 ml。

2.5田間試驗(yàn)結(jié)果

將疫苗給大腸桿菌TZY1菌株來源鴨場(chǎng)的6 000只5日齡雛鴨肌肉接種后，未見明顯副反應(yīng)，該場(chǎng)鴨大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率明顯下降，疫苗免疫保護(hù)率達(dá)95.1%，商品肉鴨出欄率提高了10.3%，效果較好。

3討論與結(jié)論

（1）劉吉山等[5]從雞、鴨、豬和兔的內(nèi)臟中首次分離到多株不同血清型的細(xì)菌天然融合株O2/O86、O1/O154、O8/O93、O53/O80、O4/O18/O142、O1/O148、O35/O107/O154等菌株，意味著細(xì)菌的血清型正向更多、更復(fù)雜、感染譜更廣的方向發(fā)展，因此制備疫苗時(shí)最好根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍械难逍椭苽湟呙纾允挂呙绲尼槍?duì)性更強(qiáng)，預(yù)防疫病效果更好。筆者利用從泰州病死鴨肝組織中分離的大腸桿菌菌株作為菌種制備疫苗，動(dòng)物保護(hù)力試驗(yàn)中免疫保護(hù)率高達(dá)100%，田間試驗(yàn)中免疫保護(hù)率高達(dá)95.1%，可能與所用菌株針對(duì)性較強(qiáng)有關(guān)。

（2）在滅活過程中，滅活疫苗免疫原性會(huì)受到一定程度的破壞，為了提高滅活疫苗的免疫效果，滅活后加入佐劑進(jìn)行配苗。目前，獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中常用佐劑有鋁膠、礦物油和蜂膠等，其中鋁膠因安全無毒、成本低廉、使用方便而應(yīng)用最廣泛。該研究所用佐劑為自制的鋁膠佐劑，經(jīng)檢驗(yàn)佐劑的性狀、膠態(tài)和吸附力等方面均符合制造獸醫(yī)生物制品用鋁膠的標(biāo)準(zhǔn)[3]，這可能也是該疫苗免疫保護(hù)效果好的原因之一。但是，鋁膠佐劑不能抗低溫，上凍的鋁膠疫苗容易變性，從而導(dǎo)致失效，因此該研究制備的鋁膠疫苗要在2～8 ℃冰箱中冷藏保存，不能冷凍保存。

以泰州某規(guī)?；B(yǎng)鴨場(chǎng)分離的鴨源大腸桿菌菌株TZY1為菌種，制備種子液，培養(yǎng)菌液，經(jīng)甲醛滅活后加入鋁膠佐劑配苗，最終制成鴨大腸桿菌自家鋁膠滅活苗，無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、動(dòng)物保護(hù)力試驗(yàn)表明制備的疫苗滅菌徹底、無外源性微生物污染，對(duì)雛鴨安全性好，每只雛鴨肌肉接種0.5 ml，14 d后進(jìn)行攻毒，發(fā)病率和死亡率均為0，免疫保護(hù)率達(dá)100%，確定該疫苗的免疫劑量為0.5 ml，用該疫苗進(jìn)行田間試驗(yàn)，免疫保護(hù)率達(dá)95.1%，表明該研究制備的鴨大腸桿菌病自家鋁膠滅活苗安全可靠，免疫效果好。

參考文獻(xiàn)

[1] 蔣新華，張文波，熊莉娟.一株鴨致病性大腸桿菌的分離鑒定及耐藥分析[J]. 中國(guó)家禽，2012，34（5）：20-22.

[2] 李剛.鄒平縣鴨源大腸桿菌分離鑒定及耐藥性檢測(cè)[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2013，30（12）：66-70.

[3] 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典：2010年版.三部[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[4] 李振清.鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌二聯(lián)自場(chǎng)疫苗的研制[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（12）：180-182.

[5] 劉吉山，沈志強(qiáng)，王燕，等.我國(guó)部分地區(qū)禽致病性大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)家禽，2005，27（7）：14-16.