張春平等

[目的]通過對黃連種子萌發(fā)及幼苗生理特性的研究，尋找提高黃連種子及幼苗在鹽脅迫條件下抗性能力的途徑。[方法]用100 mmol/L的NaCl模擬鹽脅迫，在外源水楊酸（SA）處理后，對黃連種子的發(fā)芽勢（Gv）、發(fā)芽率（Gr）、發(fā)芽指數(shù)（Gi）、活力指數(shù)（Vi），以及黃連幼苗葉片細胞質(zhì)膜透性、O2-· 產(chǎn)生速率、H2O2含量、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸及丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT） 和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性進行測定。[結(jié)果] NaCl脅迫下的黃連種子萌發(fā)受到顯著抑制，但在經(jīng)過不同濃度的SA處理后，各萌發(fā)指標均有升高。試驗結(jié)果表明，外源SA處理顯著提高了黃連種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)，明顯提高了鹽脅迫下黃連幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，不同程度地提高了葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，顯著降低了葉片丙二醛（MDA）含量、質(zhì)膜透性、O2-· 產(chǎn)生速率及H2O2含量。[結(jié)論]外源SA通過提高黃連種子的萌發(fā)指數(shù)，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性，降低細胞質(zhì)膜氧化程度，有效地減緩NaCl 脅迫對黃連種子及幼苗產(chǎn)生的傷害，提高了種子及幼苗的抗鹽能力。

關(guān)鍵詞黃連；亞精胺；鹽脅迫；種子萌發(fā)；生理特性

Abstract[Objective] In order to get the method of improving the salt resistance of seeds and seedlings for Coptis chinensis Franch. under NaCl stress， seed germination and physiological characteristics of C. chinensis seedlings were studied. [Method] Several physiological indexes of C. chinensis seeds and seedlings treated by exogenous salicylic acid under NaCl stress like the germination vigor， germination rate， germination index and vigor index were measured. And other indexes like the memberane permeability， H2O2 content， production rate of O2-， the contents of soluble surge， soluble protein， free proline， and malondialdehyde （MDA）， the activities of superoxide （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， and ascorbate peroxidase （APX） were also measured. The germination indexes of C. chinensis seeds under NaCl stress have an obvious inhibition. But after the treatment of salicylic acid， every germination indexes were all increased. [Result] The result showed that the treatment of exogenous salicylic acid obviously improved the germination vigor， germination rate， germination index and vigor index， increased the content of soluble sugars， free proline， and soluble protein， decreased the content of malondialdehyde （MDA）， H2O2 content， production rate of O2-· Meanwhile， the results also indicated that salicylic acid improve the activities of superoxide （SOD）， peroxidase （POD）， catalase （CAT）， and ascorbate peroxidase （APX）. [Conclusion] Exogenous salicylic acid with appropriate concentration could significantly alleviate the damages to the seeds and seedlings of C. chinensis under NaCl stress and promote the salt resistance of the seeds and seedlings through improve the germination indexes and antioxidase activities， decrease the memberane permeability and so on.

Key wordsCoptis chinensis Franch.； Spermidine； Salt stress； Seed germination； Physiological characteristics

黃連Coptis chinensis Franch.又名味連、川黃連、雞爪連，為毛茛科黃連屬多年生草本植物，三級漸危種[1]。野生黃連大多分布于四川、重慶、湖南、湖北、陜西、貴州省海拔1 200～1 700 m的山谷密林之中。黃連性寒、味苦，根莖入藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒等作用[2]，臨床上還用于細菌性痢疾、局部化膿性感染、心律失常、胃炎及十二指腸潰瘍等病的治療[3]。由于黃連根莖有效成分小檗堿的獨特藥效，使得藥材市場對其需求量逐年增加，目前對黃連的研究主要集中在化學成分、藥理作用、臨床應用及資源保護等方面[4-5]。對黃連栽培過程中的環(huán)境脅迫主要集中在熱脅迫、冷脅迫、干旱脅迫等方面，但對鹽脅迫的報道較少，且對外源性物質(zhì)處理緩解脅迫的報道僅見于極少量文獻[6]。

土壤鹽漬化是農(nóng)業(yè)栽培生產(chǎn)中主要障礙之一，目前我國的鹽漬土地面積不斷擴大，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失。水楊酸（SA）屬苯丙氨酸代謝途徑產(chǎn)物，屬于肉桂酸的衍生物，被認為是一種內(nèi)源信號物質(zhì)和新型植物激素，可誘導植物產(chǎn)生抗病性、抗熱性、耐寒性和抗旱性，影響根部對離子的吸收和運輸，調(diào)控細胞的生長和死亡。但在調(diào)控植物抗鹽脅迫中鮮見報道。該研究以黃連種子和幼苗為材料，研究亞精胺（Spd）對NaCl脅迫下的黃連若干生理生化指標的影響，找到Spd對鹽脅迫的緩解調(diào)節(jié)機制，為黃連在栽培生產(chǎn)中遇到的鹽脅迫問題提供理論依據(jù)和解決方法。

1材料與方法

1.1 材料

供試的黃連種子及兩年期黃連幼苗均由重慶石柱黃連培育基地提供，經(jīng)西南大學生命科學學院何平教授鑒定為C. chinensis Franch.的干燥成熟種子。亞精胺（Spd）為Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1

種子萌發(fā)生理指標的測定。

挑取籽粒飽滿、大小一致的黃連種子，用1.0%的次氯酸鈉（NaClO）溶液消毒處理5 min，蒸餾水沖洗3～5次，將種子表面水分用濾紙吸干，以鋪有雙層濾紙和雙層紗布的培養(yǎng)皿為發(fā)芽床，進行種子發(fā)芽試驗。脅迫所用的NaCl濃度為100 mmol/L，試驗共設置6個處理，即水對照（CK）、100 mmol/L的NaCl鹽處理（S）、100 mmol/L NaCl +5 mg/L SA（T1）、100 mmol/L NaCl +10 mg/L SA（T2）、100 mmol/L NaCl +20 mmol/L SA（T3）、100 mmol/L NaCl +50 mmol/L SA（T4）。在處理黃連種子時，處理液澆透培養(yǎng)皿底部，再覆蓋浸透處理液的濾紙，然后吸取培養(yǎng)皿多余的處理液，以免種子被處理液掩埋而影響萌發(fā)，種子在培養(yǎng)箱中進行（23±2）/（ 15±2） ℃（晝/夜）的變溫培養(yǎng)，光照時間設為12 h/12 h（晝/夜），光照強度為2 500 lx。每個培養(yǎng)皿100粒種子，4次重復，每天定時統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，第28天計算發(fā)芽勢（Gv），第40天計算發(fā)芽率（Gr）、發(fā)芽指數(shù)（Gi）和活力指數(shù)（Vi）。計算公式分別為發(fā)芽勢（Gv）= （28 d內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/供試的所有種子數(shù)）×100%、發(fā)芽率（Gr）=（40 d內(nèi)發(fā)芽的種子/供試的所有種子數(shù)）×100%、發(fā)芽指數(shù)（Gi）=∑ （Gt/Dt）、活力指數(shù)（Vi）=S×∑ （Gt/Dt），式中，Gt為t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應的發(fā)芽天數(shù)，S為植株的平均鮮重。

安徽農(nóng)業(yè)科學2014年

1.2.2

幼苗相關(guān)生理指標的測定。

選取長勢一致的兩年期幼苗移入小花盆中，每盆植入一株，盆中基質(zhì)按松針土

∶腐殖土∶沙土=2∶2∶1的比例混合形成。經(jīng)過10 d的緩苗期后，進行鹽脅迫試驗，共設置6個處理，即Hoagland營養(yǎng)液空白對照（CK）、Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl鹽處理（S）、Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl +10 mg/L SA（T1）、Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl +25 mg/L SA（T2）、Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl +50 mg/L SA（T3）、Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol/L NaCl +100 mg/L SA（T4），每個處理10株幼苗，3次重復，每天定期向花盆內(nèi)補充Hoagland營養(yǎng)液。分別于鹽脅迫后的第5、第10和第15天進行取樣，取樣時選取植株中等大小的功能葉片。測量的相關(guān)指標包括幼苗葉片質(zhì)膜透性、質(zhì)膜氧化程度（丙二醛含量、O2-·產(chǎn)生速率及H2O2含量）、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶 （APX）的活性。 可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量均采用張志良等的方法[7]進行測量，含量分別以mg/（g·FW）、mg/（g·FW）和μg/（g·FW）來表示。黃連幼苗葉片的原生質(zhì)膜透性采用電導儀法測定[8]，以相對電導率來表示細胞膜受脅迫傷害的程度，相對電導率=未煮之前的電導率/煮沸后的電導率×100%，測量用電導儀型號為LIDA DDS-307W。H2O2含量采用Lee等的方法[9]進行測定，在436 nm 下測量吸光度，根據(jù)標準曲線計算含量，單位為μmol/（g·FW）。

O2-· 產(chǎn)生速率采用張志良等的方法[10]進行測定，在530 nm處的吸光值，單位為μmol/（g·min·FW）。

丙二醛（MDA）含量參照Velikova等的硫代巴比妥酸（TBA）檢測法[11]，分別于532和600 nm處檢測吸光度，以μmol/（g·FW）表示丙二醛含量。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用Xu等的方法[12]，在560 nm處檢測吸光度，單位為U/（mg·protein）；過氧化物酶（POD）活性的測量方法采用愈創(chuàng)木酚法進行測量[13]，檢測波長為465 nm，單位為U/（mg·protein）；過氧化氫酶（CAT）活性的測量方法采用Dhindsa等的方法[14]，檢測波長為240 nm，單位為U/（mg·protein）；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測量方法采用Nakano等的方法[15]，于290 nm處檢測吸光度，單位為U/（mg·protein）。

1.2.3

數(shù)據(jù)處理。采用SSPS 12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，以Duncans新復級差法比較不同處理間的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對鹽脅迫下黃連種子萌發(fā)的影響

從圖1可以看出，黃連種子在不同的處理下，發(fā)芽率和發(fā)芽勢均有不同程度的變化；與未經(jīng)任何處理（CK）的發(fā)芽勢（55.36%）和發(fā)芽率（78.49%）相比，100 mmol/L的NaCl處理（S）的種子發(fā)芽勢（25.17%）和發(fā)芽率（39.22%）顯著降低，表明NaCl處理顯著抑制了黃連種子的正常萌發(fā)；當用不同濃度的SA處理后，黃連種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率與NaCl處理（S）相比均有不同程度的提高，其中經(jīng)過10 mg/L的SA處理后（T2）的結(jié)果最為顯著，發(fā)芽勢和發(fā)芽率達52.21%和76.00%，與其余各SA處理相比差異顯著。發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的變化趨勢與發(fā)芽勢和發(fā)芽率的變化相似，經(jīng)過NaCl處理后，發(fā)芽指數(shù)也顯著降低，但經(jīng)過不同濃度的SA處理后，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有明顯的升高，且也是在經(jīng)過10 mg/L的SA處理后結(jié)果最為顯著，發(fā)芽指數(shù)（32.30）和活力指數(shù)（370.00）達最大，顯著高于鹽處理S（16.37和180.39），分別為S處理的1.97和2.05倍，比空白對照（CK）略低，但差異不顯著。說明適宜濃度的SA可有效緩解鹽脅迫對黃連種子萌發(fā)造成的傷害，在提高黃連種子各萌發(fā)生理指標中具有顯著的促進效應。

2.2SA對鹽脅迫下黃連幼苗葉片細胞膜脂過氧化及質(zhì)膜透性的影響

從鹽脅迫下黃連葉片O2-·產(chǎn)生速率及H2O2含量的變化（圖2a、b）可看出，經(jīng)過NaCl進行脅迫后，兩者均有

不同程度的升高；在脅迫初期，兩者水平與對照組CK相比均發(fā)生顯著升高，且隨著脅迫時間的延長，提高幅度不斷變大；

當用外源SA進行處理后，兩者均有不同程度的降低。SA在處理初期對O2-·產(chǎn)生速率的影響表現(xiàn)為低濃度處理效果并不明顯，但隨著濃度的升高，效果越來越明顯，在濃度為50 mg/L時（T3）時降到最小值[1.290 μmol/（g·min·FW）]，且低于空白對照CK[1.249 μμmol/（g·min·FW）]。在SA處理初期，H2O2含量有明顯的降低，且同樣在濃度為50 mg/L時（T3）達最小值[1.43 μmol（g·FW）]，接近于空白對照CK[1.32 μmol/（g·FW）]，說明SA顯著地緩解了鹽脅迫下黃連葉片H2O2含量升高的趨勢。由鹽脅迫下丙二醛（MDA）含量的變化（圖2c）可見，未經(jīng)任何處理的黃連葉片MDA含量隨著時間的延長并無顯著變化，而經(jīng)過NaCl處理后（S）的黃連葉片MDA含量自脅迫初期便呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢，隨著脅迫時間的延長，升高的幅度不斷增大。在經(jīng)過SA處理后，含量均有顯著降低，處理前期（T3，5 d）達最低值[0.081 μmol/（g·FW）]。鹽脅迫初期電導率隨著脅迫程度和時間的延長而呈現(xiàn)出增大的趨勢，并在脅迫后期（15 d）達到最大，在經(jīng)過SA處理后均有不同程度的降低（圖2d）。以上結(jié)果表明在鹽脅迫下，黃連葉片細胞膜透性發(fā)生了改變，從而引起部分離子外流，導致電導率發(fā)生了變化。在經(jīng)過Spd處理后，顯著地降低了鹽脅迫下黃連葉片的相對電導率水平，保護了葉片細胞，維持了細胞膜的相對穩(wěn)定性。

2.3SA對鹽脅迫下黃連幼苗葉片滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

從不同處理鹽脅迫下黃連幼苗葉片可溶性糖含量的變化趨勢（圖3a）可看出，可溶性糖含量與對照CK相比，呈現(xiàn)出升高的趨勢，且差異顯著，但隨著NaCl處理時間的延長，可溶性糖含量升高的趨勢并不明顯；當用外源Spd進行處理后，可溶性糖含量均有不同程度的變化，SA處理隨著時間的延長呈現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢，且在處理后期（10 d），處理濃度為50 mg/L（T3）時達最大值16.90 mg/（g·FW），與鹽處理S[13.92 mg/（g·FW）]形成顯著性差異。脯氨酸含量的變化與可溶性糖趨勢基本一致，均是在未經(jīng)處理前含量最低，經(jīng)過鹽脅迫后，含量有所增加；但經(jīng)過外源SA處理后，增加幅度顯著提高，使葉片內(nèi)積累了大量的滲透性物質(zhì)，以抵抗鹽脅迫對葉片造成的傷害（圖3c）?？扇苄缘鞍自邴}脅迫下呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但經(jīng)過SA處理后，呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢，與鹽脅迫處理S相比，差異顯著，外源SA有效地減緩了葉片內(nèi)可溶性蛋白減少的趨勢，增加了可溶性蛋白的含量（圖3b）。

2.4 SA對鹽脅迫下黃連幼苗葉片4種抗氧化酶活性的影響

從圖4可以看出，在經(jīng)過鹽脅迫后，4種抗氧化酶的活性均有不同程度的提高，說明黃連幼苗對脅迫的反應比較明顯。但4種酶的具體變化規(guī)律并不完全相同，在受到鹽脅迫后，隨著脅迫時間的推移，SOD和APX呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，而POD和CAT則呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢。在經(jīng)過外源處理SA后，4種抗氧化酶的活性均呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢，并與空白對照CK和鹽處理S形成顯著差異，且當SA濃度達50 mg/L（T3）時，其效果最好。SOD、POD、CAT、APX 4種抗氧化酶的活性均在第15天時達最大值，分別為811.01、89.76、9.86和1.75 U/（mg·protein）。說明外源SA顯著地提高了4種抗氧化酶的活性，用于減輕細胞氧化程度，維持細胞正常生理活動，且具有一定的持續(xù)作用。

3 討論

鹽脅迫導致細胞膜透性增加，質(zhì)膜透性可以反映植物細胞膜的破損程度，而 MDA 是植物細胞膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，對細胞膜具有毒害作用，是衡量植物細胞膜脂過氧化程度大小的最常用指標。該試驗中，NaCl處理造成黃連幼苗葉片質(zhì)膜透性和 MDA 含量均高于對照處理，表明鹽脅迫能使植物細胞膜脂過氧化作用增強，膜透性增加，加劇植物的氧化損傷。但當用外源SA處理以后，MDA含量顯著降低，說明SA對減緩鹽脅迫所造成的傷害具有積極的緩解作用，通過外源物質(zhì)的處理，有效地降低了H2O2含量及O2-·的產(chǎn)生速率，緩解了兩者對細胞膜造成的氧化傷害，從而降低了細胞膜的透性。

SOD、POD、CAT和APX 是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的4個重要保護酶，這些酶類共同作用維持細胞內(nèi)活性氧代謝的平衡，從而使需氧生物體免受傷害。該研究中，在經(jīng)過SA處理后，黃連幼苗葉片中4種抗氧化酶均表現(xiàn)出明顯的變化，但變化趨勢略有不同，說明4種酶在遇到脅迫時具有不同的分工，在經(jīng)過外源SA處理以后，4種酶的活性大幅度升高以抵抗過氧化對細胞帶來的傷害，有效地清除因為膜質(zhì)過氧化積累下來的活性氧，以實現(xiàn)緩解氧化的目標。該試驗結(jié)果也證明了外源SA通過誘導抗氧化酶活性來降低活性氧水平，減輕氧化脅迫對黃連幼苗造成的傷害。

SA通常被認為是植物在逆境脅迫反應中產(chǎn)生的一種信號分子，其作用機理之一可能就是SA抑制了MDA累積引起的膜脂過氧化，保護了細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這與SA對小麥鹽害及水分脅迫的緩解作用機理相似[16]。研究表明，100～200 mg/L的SA在緩解甜瓜鹽害中的作用較明顯，這與宋士清等在黃瓜幼苗中的研究結(jié)果[17-18]相符合。李兆亮等分析發(fā)現(xiàn)非鹽脅迫下SA對CAT活性有微弱的抑制作用[19]。在該研究中，鹽脅迫條件下，外源SA對CAT活性有明顯的促進作用，這可能與SA濃度及鹽脅迫條件有關(guān)。

綜上所述，SA通過提高鹽脅迫下黃連幼苗的抗氧化酶活性，加強清除活性氧能力，增加膜穩(wěn)定性，降低細胞滲透勢，減少膜質(zhì)過氧化作用，從而緩解黃連幼苗所受的氧化損傷，增強了其抗鹽性。

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