張瑜等

摘要[目的]研究4種柱花草種子在萌發(fā)過程中4種貯藏蛋白質(zhì)含量的變化。[方法]用Bradford 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒對提取的蛋白進(jìn)行測定。[結(jié)果]4種柱花草胚中貯藏蛋白質(zhì)含量的大小順序?yàn)榍虻鞍?白蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。球蛋白在胚生長時(shí)期大量降解，含量總體下降了43%；白蛋白在種子開始萌發(fā)時(shí)下降很快，下降幅度為39%；萌發(fā)后期種子胚芽長到4.3 cm時(shí)白蛋白含量降低了58%；在整個(gè)萌發(fā)過程中醇溶蛋白含量的變化與谷蛋白含量的變化相似，都呈波浪狀變化，醇溶蛋白降解幅度最小。而總蛋白質(zhì)含量在整個(gè)萌發(fā)階段是隨著萌發(fā)的進(jìn)行而逐漸減少，其中有鉤柱花草總蛋白含量的降解幅度最大，為49%；其余差異不明顯。[結(jié)論]4種柱花草的種子萌發(fā)早期蛋白質(zhì)的降解幅度大于萌發(fā)后期蛋白質(zhì)的降解幅度。在種子萌發(fā)初期，柱花草種子中的貯藏蛋白質(zhì)有不同程度的降解，為胚的生長發(fā)育提供需要的營養(yǎng)物質(zhì)。在種子萌發(fā)后期，胚突破種皮形成幼芽，種子由異養(yǎng)逐漸向自養(yǎng)過渡，降解幅度減小。

關(guān)鍵詞柱花草；貯藏蛋白質(zhì)；種子萌發(fā)

中圖分類號S541+.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2014）36-12810-04

Abstract [Objective] The four kinds of storage protein contents changed in four Stylo seed germination. [Method] To determine the extraction of protein by Bradford protein assay kit. [Result] The results showed that the storage protein content of Stylo seed embryo in the size of globulin>albumin>glutenin>prolamin. Globulin had a large number of degradation in the embryo period ， the contents dropped 43% totally. Albumin decreased rapidly in the begin of germination， by 39%. In the late stage of germination， while the seed germ grow to 4.3 cm， albumin content reduced 58%. The change of protein content in the whole germination had wavy， prolamin resembled with glutenin， its degradation was the smallest. The total protein content in the whole germination stage reduced gradually， the total protein of hook Stylos degraded maximum， by 49%. The rest of the difference was not obvious. [Conclusion] Protein degradation in earlier stage was greater than the later stage in seed germination. At the beginning of Stylos seed germination， storage proteins had difference degradation， which provide nutrients to embryo growth and development， at the later period bud through the seed coat， the degradation decreased， the seeds transited from heterotrophic to autotrophic gradually.

Key words Stylo； Storage protein； Seed germination

柱花草屬（Stylosanthes SW.）為多年生豆科植物，廣泛分布于世界熱帶、亞熱帶地區(qū)。柱花草性喜濕熱，耐酸瘦土，抗炭疽病，適生于我國熱帶、南亞熱帶地區(qū)，目前在海南、廣東、廣西等省區(qū)的推廣面積約53萬hm2。柱花草產(chǎn)量高，枝葉營養(yǎng)豐富，干物質(zhì)粗蛋白含量15%～16%，同時(shí)含有多種氨基酸，是畜禽的優(yōu)良飼料。柱花草根系發(fā)達(dá)，并且具有生物固氮能力，可固氮225～300 kg/hm2，是幼齡果園和熱帶經(jīng)濟(jì)林的理想綠肥作物，對防止雨水沖刷、保持水土、改良和培肥土壤、促進(jìn)果樹、林木生長發(fā)育具有顯著作用。人們可充分利用荒山荒坡、果園、熱帶經(jīng)濟(jì)作物園和林間空地種植柱花草，以發(fā)展食草型、節(jié)糧型畜禽，為飼料工業(yè)主產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)草粉。目前關(guān)于柱花草的研究主要集中于植株形態(tài)、高產(chǎn)栽培技術(shù)、種子生產(chǎn)技術(shù)、品質(zhì)、抗性、品種選育、飼料開發(fā)以及遺傳多樣性研究等方面，對種子發(fā)芽機(jī)理、機(jī)制的研究很少[1-10]。

貯藏蛋白質(zhì)（Storage protein）是種子內(nèi)貯藏物質(zhì)的重要組分之一，為種子萌發(fā)和幼苗早期生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和能源[11]。種子內(nèi)貯藏蛋白質(zhì)主要以蛋白體形式存在，主要包括球蛋白（Globulin）、白蛋白（Albumin）、醇溶蛋白（Prolamin）和谷蛋白（Glutelin）四類。豆科種子中蛋白質(zhì)含量豐富，以球蛋白為主（占60%～75%）[12-15]。種子貯藏蛋白質(zhì)的降解一般分為三個(gè)步驟：①貯藏蛋白被修飾；②被修飾的貯藏蛋白（大分子）被肽鏈內(nèi)切酶降解成小分子蛋白（肽）；③小分子蛋白被肽酶降解成氨基酸。子葉、下胚軸中蛋白質(zhì)降解所得的部分氨基酸會重新合成新的蛋白質(zhì)。在種子萌發(fā)早期，胚中這種蛋白質(zhì)積累，可能是為幼苗生長提供營養(yǎng)，對幼苗存活具有重要意義[16-21]。筆者對4種柱花草種子萌發(fā)時(shí)胚中4種貯藏蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白）的降解和總蛋白含量的動態(tài)變化進(jìn)行研究，旨在研究種子蛋白質(zhì)的多態(tài)性，為科學(xué)保護(hù)和充分利用柱花草地方品種資源及育種研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料來源

試驗(yàn)所用柱花草有

熱研2號柱花草（S. guianensis SW. cv. Reyan No.2）、維拉諾有鉤柱花草（S. hamata （L.）Taub.cv. Verano）、西卡柱花草（S. scabra Vog cv. Seca）、馬弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）。種子產(chǎn)于海南省儋州市那大鎮(zhèn)寶島新村牧草基地，于2013年2月開始收集。

1.2方法

2013年4月8日開始，各選取50粒飽滿健康、大小一致的種子進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，設(shè)4個(gè)重復(fù)。播種前用80 ℃熱水浸泡2～3 min后取出冷卻，將處理后種子播種于放置2層濾紙（相對濕度60%～80%）的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱（25 ℃，濕度為80%～90%）中發(fā)芽，每隔2 d噴一次水以保持濾紙的濕潤。

1.3樣品制備根據(jù)不同的發(fā)芽時(shí)間進(jìn)行取樣，分別是發(fā)芽的第2、3、4、5、6、7天。用解剖刀把胚分成子葉、胚軸、胚根，裝入相對應(yīng)的密封塑料袋中，貼好標(biāo)簽，放入-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。每次取樣時(shí)挑出腐爛霉變的種子丟掉。

1.4測定項(xiàng)目

稱取樣品1 g左右，貯藏蛋白質(zhì)通過以下方法進(jìn)行分離。①白蛋白的分離方法為：用l0 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）緩沖液室溫提取2 h，10 000 r/min低溫離心10 min，取上清液備用；②球蛋白的分離方法為：用1 mol/L NaCl、10 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）緩沖液室溫提取2 h，其他同上；③醇溶蛋白的分離方法為：用70%（V/V）乙醇、10 mmol/L TrisHCl（pH 7.5）緩沖液室溫提取2 h，其他同上；④谷蛋白的分離方法為：用濃度0.5%十二烷基硫酸鈉、濃度1%巰基乙醇、10 mmol/L TrisHCL（pH7.5）緩沖液室溫提取2 h，其他同上。用Bradford 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒對提取的蛋白進(jìn)行分析測定。

1.5數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)所測定的數(shù)據(jù)用Excel分析。

2結(jié)果與分析

2.1柱花草種子萌發(fā)過程中各貯藏蛋白質(zhì)含量的變化

種子發(fā)芽是一個(gè)需要大量能量的過程。子葉中貯藏著富含化學(xué)能的有機(jī)物。在種子萌發(fā)過程中，有機(jī)物在釋放能量的同時(shí)，轉(zhuǎn)化成胚易吸收的形態(tài)[22]。當(dāng)種子萌發(fā)，種子中的貯藏蛋白質(zhì)在各種酶的作用下降解為小分子氨基酸，供給新蛋白質(zhì)和其他代謝物質(zhì)合成之用[23-24]。根據(jù)4種柱花草種子萌發(fā)程度的不同，選取柱花草萌發(fā)的5種不同狀態(tài)的胚為樣品進(jìn)行4種蛋白質(zhì)含量的測定。由圖1～4可知，柱花草種子胚中4種蛋白質(zhì)含量的大小順序?yàn)榍虻鞍?白蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。

2.1.1熱研2號柱花草種子不同萌發(fā)期球蛋白含量的變化。

由圖1可知，球蛋白是柱花草種子中4種貯藏蛋白質(zhì)中含量最高的蛋白質(zhì)，在熱研2號柱花草種子整個(gè)萌發(fā)過程中含量逐漸下降，到種子發(fā)芽末期，子葉中球蛋白含量總體下降了43%。在種子萌發(fā)初期球蛋白大量降解，萌發(fā)后期胚突破種皮形成幼芽后種子由異養(yǎng)逐漸向自養(yǎng)過渡，球蛋白的降解幅度減緩，從萌發(fā)4期到萌發(fā)5期球蛋白含量下降了12%。

2.1.2有鉤柱花草種子不同萌發(fā)期白蛋白含量的變化。由圖2可知，在有鉤柱花草種子的整個(gè)發(fā)芽階段，白蛋白含量逐漸減少。當(dāng)種子開始萌發(fā)時(shí)白蛋白含量下降很快，到萌發(fā)后期白蛋白含量降低了58%。從萌發(fā)3期到萌發(fā)5期，白蛋白含量下降了27%。有鉤柱花草種子白蛋白的含量僅次于球蛋白含量，是4種蛋白質(zhì)中降解幅度較大的蛋白質(zhì)，說明白蛋白是柱花草種子貯藏蛋白質(zhì)的主要組分之一。

2.1.3西卡柱花草種子不同萌發(fā)期谷蛋白含量的變化。

由圖3可知，在西卡柱花草種子的胚生長期和幼芽生長中期，谷蛋白含量略降低4%；到萌發(fā)4期，谷蛋白含量僅降低33%；到幼苗生長期，谷蛋白含量稍有增加，幅度為9%。在整個(gè)萌發(fā)過程中，谷蛋白含量變化幅度小，呈波浪狀變化。谷蛋白在西卡柱花草種子整個(gè)萌發(fā)期間除醇溶蛋白以外是其他3種蛋白質(zhì)中降解幅度最小的蛋白質(zhì)。分析得出，在種子胚和幼芽生長初期，可能是由于此時(shí)需要許多的營養(yǎng)物質(zhì)，谷蛋白在蛋白酶的作用下分解為各種氨基酸，含量降低。谷蛋白中含有豐富的谷氨酸和天門冬氨酸等氨基酸，是合成許多關(guān)鍵酶的原材料，所以后期重新合成谷蛋白，使其含量增加[25]。

在種子胚生長和幼芽生長初期醇溶蛋白含量增加，可能是由于萌發(fā)初期各種營養(yǎng)物質(zhì)的降解需要足夠多的酶來催化，因此一些酞胺類氨基酸又重新合成酶[26-27]。新合成的蛋白質(zhì)（酶蛋白）調(diào)節(jié)其他物質(zhì)的代謝變化，所以醇溶蛋白含量增加。

2.2柱花草種子萌發(fā)過程中總貯藏蛋白質(zhì)含量的變化

在柱花草種子萌發(fā)過程中，當(dāng)種子未露白時(shí)胚生長消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，蛋白質(zhì)迅速分解，降解幅度大。在種子露白后，幼芽開始生長，蛋白質(zhì)降解幅度變小。這是由于種子幼芽由異養(yǎng)轉(zhuǎn)變成為自養(yǎng)，總蛋白質(zhì)的降解幅度在萌發(fā)后期下降?？傊ú莘N子的萌發(fā)就是貯藏蛋白質(zhì)不斷降解成小分子化合物，從貯藏部位運(yùn)送到利用部位以及分解的氨基酸重新組合成新的蛋白質(zhì)的過程。總蛋白降解幅度的變化在一定程度上證明柱花草種子萌發(fā)是從異養(yǎng)到自養(yǎng)的過程。

2.2.1熱研2號柱花草種子不同萌發(fā)期總蛋白質(zhì)含量的變化。

由圖5可知，熱研2號柱花草種子萌發(fā)過程中總蛋白含量在整個(gè)萌發(fā)階段逐漸減少，總蛋白的降解幅度為42%。在種子萌發(fā)初期胚突破種皮生長時(shí)，蛋白質(zhì)的降解幅度相對較大，達(dá)到24%左右。而幼芽開始生長發(fā)育后總蛋白質(zhì)的降解程度減小，降解幅度為4%左右。

3結(jié)論與討論

研究表明，柱花草種子萌發(fā)過程中胚的4種貯藏蛋白質(zhì)含量大小順序?yàn)榍虻鞍?白蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白。不同種類貯藏蛋白質(zhì)的降解方式和降解程度不同。球蛋白和白蛋白是降解最多的蛋白質(zhì)，是胚和幼芽生長的主要氮源。在整個(gè)萌發(fā)過程中，醇溶蛋白含量的變化與谷蛋白含量的變化相似，都呈波浪狀變化。蛋白質(zhì)總含量在4種柱花草種子整個(gè)萌發(fā)階段是隨著萌發(fā)的進(jìn)行而逐漸減少，種子萌發(fā)早期蛋白質(zhì)的降解幅度大于萌發(fā)后期蛋白質(zhì)的降解幅度。

醇溶蛋白中含有豐富的谷酞胺和脯氨酸，其降解生成的脯氨酸能夠保護(hù)植株幼體免受外界不良環(huán)境的影響[28-29]。在柱花草種子萌發(fā)后期，這種蛋白質(zhì)的積累可能是為幼苗生長提供營養(yǎng)，對提高幼苗存活具有重要意義。而谷蛋白含量在總體上變化不明顯，說明谷蛋白不是提供胚和幼芽生長的營養(yǎng)蛋白，有可能是功能蛋白或結(jié)構(gòu)蛋白，需深入研究。

該研究分析了4種柱花草種子萌發(fā)和幼芽生長發(fā)育過程中貯藏蛋白質(zhì)的代謝規(guī)律，為今后改進(jìn)代謝途徑來提高柱花草種子的發(fā)芽速度、整齊度以及幼苗存活率和抗逆性等提供理論指導(dǎo)，對柱花草的種子生產(chǎn)有重要意義。研究柱花草種子貯藏蛋白質(zhì)的多樣性，可為結(jié)合柱花草新品種登記和保護(hù)、品種親緣關(guān)系和分類研究以及構(gòu)建蛋白質(zhì)指紋圖譜等方面提供一定的理論依據(jù)。

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